肺复方通过PI3K/Akt/Nrf2信号通路对A549/DDP细胞耐药性的影响

目的观察肺复方对人肺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞耐药性的作用及对PI3K/Akt/Nrf2信号通路的影响。方法选用A549/DDP细胞设立不含药血清的空白对照组、肺复方组、顺铂组、联合组,流式细胞术检测各组细胞周期分布和细胞中活性氧(ROS)的变化,Western blotting和RT-PCR检测PI3K/Akt/Nrf2信号通路及下游血红素氧合酶1(HO-1)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)的表达变化。结果与空白对照组、顺铂组相比,联合组引起细胞G1期阻滞,增加细胞内活性氧的累积,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与空白对照组比,肺复方组和联合组能减少Nrf2核转位,下调p-Akt、HO-1、NQO1、MRP1蛋白表达和mRNA表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论肺复方能够通过调控PI3K/Akt/Nrf2信号通路增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。

补中益气汤含药血清对TGF-β介导的A549/DDP细胞Snail、E-cadherin表达的影响

目的观察补中益气汤含药血清对转化生长因子(TGF)-β1诱导前后,A549/DDP细胞Snail、E-钙黏蛋白(cadherin)表达的影响,探讨补中益气汤对A549/DDP细胞上皮-间充质转化(EMT)的干预作用。方法A549/DDP细胞分为:空白组、TGF-β1组(TGF-β15 ng/L,48 h)、中药组(10%补中益气汤含药血清)、干扰组(Snail干扰)。采用siRNA技术,运用免疫细胞化学法、Western印迹法、实时荧光定量PCR法,检测补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞Snail、E-cadherin及mRNA水平的影响。结果与空白组比较,TGF-β1组E-cadherin及mRNA表达水平显著下调(P<0.05);与TGF-β1组比较,中药组及干扰组E-cadherin及mRNA表达水平显著上调(P<0.05)。而Snail蛋白及mRNA水平的影响呈现相反的变化趋势。结论Snail作为转录因子,可抑制E-cadherin基因的表达,诱导EMT发生,而补中益气汤含药血清可通过干预Snail蛋白及基因的表达,解除其对E-cadherin的抑制作用,从而逆转A549/DDP细胞EMT。

白杨素通过下调Annexin A3逆转人肺腺癌A549/DDP细胞顺铂的耐药性

目的观察白杨素对肺腺癌顺铂(DDP)耐药性细胞A549/DDP耐药敏感性的影响。方法取A549和A549/DDP细胞,qRT-PCR及Western blot法检测膜联蛋白A3(Annexin A3)基因及蛋白表达,CCK-8法测不同浓度白杨素(0、5、25、50、100 mmoL/L)干预后细胞生存率;将A549/DDP细胞分为A549/DDP组、白杨素组(50 mol/L)、Annexin A3过表达组(Annexin A3mimic组)、Annexin A3阴性对照组(Annexin A3 NC)、白杨素+Annexin A3mimic组,另取A549细胞正常培养作为空白对照组;CCK-8法检测细胞对DDP的半数生存浓度(IC50)及耐药指数;qRT-PCR和Western blot法检测Annexin A3基因和蛋白表达水平,流式细胞义监测细胞凋亡率,小鼠荷瘤实验检测移植瘤体积。结果不同浓度的白杨素均能时效依赖性和剂量依赖性降低A549、A549/DDP细胞生存率(P<0.05),选取50 mol/L为实验浓度作用细胞48 h;与A549细胞比较,A549/DDP细胞Annexin A mRNA及蛋白表达、对DDP的IC50、耐药指数均升高,凋亡率降低(P<0.05);与A549/DDP组比较,白杨素组细胞IC50、耐药指数、Annexin A3 mRNA及蛋白表达降低,细胞凋亡率升高(P<0.05),Annexin A3 mimic组细胞IC50、耐药指数、Annexin A3 mRNA及蛋白表达升高,细胞凋亡率降低(P<0.05);Annexin A3基因高表达可减弱A549/DDP细胞对白杨素的敏感性,降低细胞凋亡率(P<0.05);小鼠荷瘤实验证实,与单独的DDP治疗组比较,白杨素与DDP联合治疗可显著降低小鼠A549/DDP移植瘤瘤体体积(P<0.05),Annexin A3基因高表达的小鼠逆转白杨素与DDP联合治疗效果(P<0.05)。结论白杨素可能通过下调Annexin A3表达,逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性。

臭椿酮对非小细胞肺癌顺铂耐药细胞A549/DDP的增敏作用

目的探讨臭椿酮(AIL)对非小细胞肺癌顺铂耐药细胞系A549/DDP的增敏作用。方法采用MTT检测AIL对A549和A549/DDP细胞活力的影响;Chou-Talalay中效法分析臭椿酮与顺铂的联合用药指数(CI);流式细胞术检测细胞周期及凋亡,Western blotting法检测凋亡相关蛋白表达水平。结果AIL(0.6μmol/L)与DDP(50μg/mL)联合用药有协同作用;细胞周期阻滞在G1期,同时细胞凋亡率升高;Caspase-3和Bcl-2蛋白表达下降,Cleaved Caspase3、Bax、CDK4和CyclinD1的蛋白表达升高。结论AIL可增强A549/DDP细胞对DDP的敏感性,协同DDP抑制A549/DDP细胞的生长,促进其凋亡。

淫羊藿苷通过IL-6/STAT3通路逆转肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药的作用机制研究

目的 探讨淫羊藿苷(ICA)对A549/DDP细胞顺铂耐药的逆转作用及对白细胞介素-6(IL-6)和信号传导子及转录激活子3(STAT3)信号通路的调节。方法 第4代对数生长期的A549/DDP细胞随机分为A549/DDP组和ICA组,MTT法检测不同浓度ICA对细胞增殖率的影响。采用不同浓度DDP及50、100μmol/L ICA处理A549/DDP细胞,MTT法检测ICA对A549/DDP细胞化疗敏感性的影响。采用4μg/mL DDP和50、100μmol/L ICA处理A549/DDP细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Transwell试验检测细胞侵袭能力,qRT-PCR检测细胞中肺耐药蛋白(LRP)和多药耐药蛋白(MRP) mRNA相对表达量,蛋白印迹法检测IL-6、STAT3、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白相对表达量。结果 细胞增殖率随ICA浓度的增加而降低(P<0.05)。与单独使用不同浓度DDP处理A549/DDP细胞比较,50和100μmol/L ICA处理提高细胞对DDP的敏感性,降低DDP对细胞的半数抑制浓度(IC50)(P<0.05)。50和100μmol/L ICA处理A549/DDP细胞,细胞侵袭能力减弱、LRP和MRP mRNA相对表达量以及IL-6、STAT3和Bcl-2蛋白相对表达量降低,细胞凋亡率和Bax蛋白相对表达量升高。结论 ICA可增强A549/DDP细胞对DDP的敏感性,逆转耐药性,其可能是通过抑制IL-6/STAT3信号通路发挥作用。

吴茱萸碱逆转人肺癌细胞株A549/DDP耐药机理的实验研究

目的观察吴茱萸碱逆转人肺腺癌耐药株A549/DDP细胞耐药性的效果并探讨其与阻断NF-κB信号传导通路的相关性。方法采用MTT法检测单用吴茱萸碱、顺铂(DDP)以及两药联用在不同时间对A549/DDP细胞的增殖影响,计算IC50及耐药逆转倍数。流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。RT-PCR检测各组MDR1、NF-κB、Bcl-2、MMP-2和VEGF的mRNA表达。Westernblot法检测各组细胞的pIκB-α、pIKKα蛋白表达水平。结果吴茱萸碱0.125mg/L、0.25mg/L针对A549/DDP细胞对DDP的耐药逆转倍数分别为3.668和11.48。RT-PCR显示在吴茱萸碱作用下检测基因的mRNA表达随着吴茱萸碱浓度的增加和时间的延长其表达逐渐下降。当吴茱萸碱与DDP联用时,可明显提高A549/DDP细胞对化疗药的敏感性,凋亡细胞显著增加(P<0.05)。Westernblot法结果提示A549/DDP细胞中pIκB-α的表达水平随着吴茱萸碱作用时间的延长逐渐下降,pIKKα表达则无显著变化。结论吴茱萸碱可以通过抑制IκB-α的磷酸化阻断NF-κB信号通路,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,增加耐药细胞对DDP的敏感性。

人参单体Rh_2诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡的体外研究

背景与目的肺癌已成为人类癌症主要死亡原因之一。从植物中开发抗肿瘤药物是国内外抗肿瘤新药开发的一个热点。本研究的目的是观察人参单体Rh2诱导人肺腺癌A549/DDP细胞系凋亡的作用,并探讨其可能的分子机制。方法体外培养的人肺腺癌A549/DDP细胞经不同浓度梯度的人参单体Rh2干预,分别应用MTT实验观察其对细胞增殖的影响,用流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数及相关基因表达的改变,以及用双抗体夹心ELISA法测定细胞上清液sApo-1/Fas浓度变化。结果①人参单体Rh2可抑制A549/DDP细胞的生长,并呈剂量、时间依赖作用。②人参单体Rh2处理A549/DDP细胞24h,实验组凋亡指数显著高于对照组(P<0.001),G0/G1期细胞比例显著高于对照组(P<0.01),S期细胞比例显著低于对照组(P<0.01),G2/M期细胞比例与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。③实验组p53、Fas阳性表达率显著高于对照组(P<0.01,P<0.001),Bcl-2阳性表达率显著低于对照组(P<0.001)。④实验组A549/DDP细胞培养上清液于不同时间sApo-1/Fas含量均显著低于对照组(P<0.05)。结论人参单体Rh2具有诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡的作用,其分子机制可能是上调p53和Fas及下调Bcl-2的表达、通过Fas/FasL系统途径诱导细胞凋亡。

消岩汤药物血清对A549/DDP多药耐药逆转作用的研究

[目的]探讨消岩汤药物血清对接种S180昆明小鼠肿瘤的抑制作用,及对耐顺铂人肺腺癌细胞系A549/耐顺铂(DDP)的耐药逆转作用。[方法]通过建立小鼠肿瘤模型,观察消岩汤对小鼠S180移植肿瘤生长的影响;以人肺腺癌敏感细胞A549和耐药细胞A549/DDP为研究对象,采用细胞毒实验(MTT)方法,探讨消岩汤对肺癌耐药细胞的多药耐药逆转作用。[结果]消岩汤高、低剂量组的抑瘤率分别是48.36%和27.87%;消岩汤荷瘤动物含药血清高、低剂量组分别与DDP合用时,对耐药细胞A549/DDP的杀伤作用分别是DDP组的1.78倍和1.57倍。[结论]消岩汤可改善小鼠生活质量,拮抗恶病质,并能够抑制肿瘤生长;消岩汤含药血清对A549及A549/DDP均有生长抑制作用,且能增强DDP对肺癌敏感细胞和耐药细胞的杀伤作用,具有耐药逆转作用。

基因工程腺病毒H101逆转A549/DDP细胞对顺铂耐药性的实验研究

背景及目的:耐药性产生是化疗失败的主要原因之一,克服耐药性的方法之一是使用逆转剂。目前尚无一种理想的、可应用于临床的顺铂(DDP)耐药逆转剂。本研究探讨基因工程腺病毒H101对DDP耐药性的逆转作用及其机制。方法:体外利用人肺腺癌细胞株A549的DDP耐药模型A549/DDP,采用MTT法检测H101对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用。用流式细胞仪(FCM)测定细胞多药耐药蛋白1(multidrugresistantprotein1,MRP1)、谷胱甘肽鄄S鄄转移酶(GST)及TOPO鄄Ⅱ蛋白表达量,荧光鄄考马斯亮蓝法检测细胞内GSH含量,原子吸收法测定细胞内铂浓度。结果:A549/DDP细胞对DDP的耐药指数为14.3。加入H101后,DDP对A549/DDP的半数抑制浓度(IC50)由352.4μmol/L降至61.6μmol/L,逆转倍数为5.7倍。FCM检测结果显示,A549/DDP细胞的GST和TOPO鄄Ⅱ蛋白水平均较A549细胞高,而两种细胞内均未检测到MRP1的表达,经H101处理后的A549/DDP细胞胞内GST蛋白和TOPO鄄Ⅱ蛋白水平均明显下降。A549/DDP胞内GSH含量比A549高2倍多;H101感染A549/DDP细胞后,胞内的GSH含量下降,随着H101剂量的增加,胞内GSH含量逐渐下降,达A549细胞内GSH水平。原子吸收法测定细胞内铂含量的结果显示,A549细胞内铂含量是A549/DDP细胞内铂含量的3倍,加入H101后,A549细胞内铂的含量无明显变化,但A549/DDP细胞内铂的含量明显增加。结论:H101能逆转A549/DDP对DDP的耐药性,H101逆转DDP耐药性的机制可能是减少A549/DDP细胞内GSH和TOPOⅡ蛋白的水平,增加了A549/DDP细胞内铂的蓄积。

白花蛇舌草乙醇提取物对肺腺癌A549/DDP细胞的耐药逆转及其机制

目的探讨白花蛇舌草乙醇提取物在体外对肺腺癌A549/DDP细胞株的耐药逆转作用及对多药耐药相关蛋白(MRP)表达的影响。方法MTT法测定白花蛇舌草乙醇提取物对A549/DDP细胞耐药的逆转作用;半定量RT-PCR和Western Blot分别检测肿瘤细胞MRP mRNA和蛋白的表达。结果白花蛇舌草乙醇提取物使A549/DDP细胞对DDP的耐药倍数由10.294下降至5.586;并显著降低A549/DDP MRP mRNA和蛋白的表达。结论白花蛇舌草乙醇提取物可以部分逆转肺腺癌A549/DDP细胞对DDP的耐药;其逆转作用可能通过降低细胞MRP的表达来实现。

姜黄素对人肺腺癌A549/DDP细胞增殖活性的影响

目的:探讨姜黄素对人肺腺癌A549/DDP细胞增殖活性的影响.方法:采用细胞计数法绘制亲代A549和A549/DDP细胞生长曲线,MTT法测定A549/DDP对顺铂的耐药指数以及姜黄素对A549/DDP细胞抑制率.将不同浓度姜黄素作用于A549/DDP细胞24h后,Hoechst33258染色荧光显微镜下观察细胞核形态,流式细胞仪检测细胞凋亡率.以20μmol/L的姜黄素作用细胞24h后,流式细胞仪分析细胞周期.结果:亲代A549细胞和A549/DDP细胞的生长曲线相似,倍增时间分别为(33.24±0.24)h和(32.88±0.11)h(P>0.05);顺铂处理A549和A549/DDP细胞72h后,半数抑制浓度(IC50)分别为13.57μmol/L和146.79μmol/L,A549/DDP细胞对顺铂的耐药指数为10.82.姜黄素对A549/DDP细胞增殖有抑制作用,并且呈时间浓度依赖性(P<0.05).姜黄素作用后,Hoechst染色显示A549/DDP细胞核缩小变形,致密浓染荧光成团块分布.流式细胞仪分析结果示细胞凋亡率呈明显剂量依赖关系(P<0.05).20μmol/L的姜黄素作用细胞24h,引发G2期阻滞.结论:姜黄素对人肺腺癌A549/DDP细胞增殖具有抑制作用,并呈时间、浓度依赖.其作用可能是通过阻滞细胞周期进程和诱导细胞凋亡来实现的.

橙皮苷诱导人非小细胞肺癌A549/DDP细胞凋亡的实验研究

目的观察橙皮苷对人非小细胞肺癌A549/DDP细胞凋亡的影响。方法培养耐顺铂的人非小细胞肺癌A549/DDP细胞,分别用6,12,24,48和96 mg/L橙皮苷作用A549/DDP细胞24 h,在荧光显微镜下观察细胞形态变化,采用流式细胞计量仪检测细胞凋亡情况。结果经不同浓度的橙皮苷作用A549/DDP细胞24h后,镜下见A549/DDP细胞核缩小变形,致密浓染,荧光成团块分布;流式细胞计量仪检测结果显示,6mg/L橙皮苷即可促使A549/DDP细胞出现早期凋亡,且凋亡率随橙皮苷剂量增大而逐渐增加,呈现出明显的剂量依赖关系(P<0.05)。结论橙皮苷可以诱导A549/DDP细胞凋亡。

桔梗皂苷-D诱导肺腺癌A549和A549/DDP细胞凋亡和周期阻滞

目的:探究桔梗皂苷-D(Platycodin-D,PD)诱导肺腺癌细胞(A549)和A549顺铂耐药细胞(A549/DDP)凋亡和周期抑制的作用机制,为PD治疗非小细胞肺癌和产生顺铂耐药的非小细胞肺癌提供实验基础。方法:采用MTT法检测细胞的增殖抑制率和耐药指数;流式细胞术检测细胞周期阻滞和凋亡作用;Hoechst-33258荧光染色观察细胞核形态的变化;Western-blot蛋白印迹法分析凋亡通路和细胞周期相关蛋白表达水平的变化。结果:MTT检测结果显示,PD对A549和A549/DDP细胞的增殖抑制呈浓度和时间依赖性。Hoechst 33258荧光染色发现,随着PD浓度增加,两种细胞核形态都有明显的改变。进一步流式细胞术结果表明,PD诱导A549和A549/DDP细胞凋亡和周期阻滞。Westernblot检测结果表明,PD通过上调Bax、Caspase-9、cleaved-Caspase-3和PARP的表达,下调Bcl-2和Caspase-3的表达诱导A549和A549/DDP细胞凋亡。此外,PD通过下调Cyclin-D1、Cyclin-D3、CDK4、CDK6、E2F1和p-Rb及上调P18的蛋白水平诱导A549细胞周期G0/G1阻滞。同时,PD通过下调Cyclin-B1、p-Cdc2、E2F1和p-Rb及上调P27的蛋白表达诱导A549/DDP细胞周期G2/M阻滞。结论:PD通过线粒体途径诱导A549和A549/DDP细胞凋亡诱导,并且引发A549细胞G0/G1周期阻滞和A549/DDP细胞G2/M阻滞周期阻滞。

在顺铂耐药的A549/DDP人肺腺癌细胞中乙醛脱氢酶表达增加

目的观察乙醛脱氢酶(ALDH)在A549/DDP人肺腺癌耐顺铂细胞中的表达及在顺铂耐药性中的功能。方法流式细胞术检测肿瘤干细胞标志分子CD44、CD90、CD73、CD105、上皮细胞黏附分子(Ep CAM)、ATP结合盒式超家族G成员2(ABCG2)以及ALDH在A549细胞和A549/DDP细胞表达的阳性率;MTT法检测100μmol/L二乙氨基苯甲醛(DEAB)处理前后A549/DDP细胞的增殖能力和对顺铂的敏感性;实时定量PCR检测ALDH各亚型在A549细胞与A549/DDP细胞中的mRNA水平的表达;Western blot法检测实时定量PCR有明显差异结果的ALDH的亚型ALDH1A3和ALDH1B1在A549细胞与A549/DDP细胞中的蛋白水平的表达。结果与A549细胞相比,ABCG2和ALDH在A549/DDP细胞的阳性率增加,ALDH阳性率达97.7%,在A549细胞中仅仅为4.3%;CD44、CD90、CD73、CD105在二者间阳性率无明显差异,而Ep CAM在A549/DDP细胞阳性率降低;经100μmol/L DEAB处理后,A549/DDP细胞对顺铂的耐药性显著低于未处理前;与A549细胞相比,ALDH1A3和ALDH1B1的mRNA在A549/DDP细胞中表达水平增高;ALDH1B1蛋白表达升高,ALDH1A3表达降低。结论 ALDH可作为顺铂耐药人肺腺癌细胞的标志分子之一,其中ALDH1B1在顺铂耐药性中可能发挥一定作用,为临床上治疗肺腺癌耐药患者提供新的治疗靶点和策略。

金复康口服液对耐药人肺腺癌A549/DDP膜转运蛋白LRP MRPmRNA表达的影响

目的:从逆转多药耐药的角度,研究金复康口服液对耐药人肺腺癌细胞A549/DDP的化疗增效的作用和分子机制。方法:应用血清药理学方法,选择A549、A549/DDP细胞,实验分为实验组和空白对照组,从细胞水平、分子水平进行研究。结果:金复康口服液低剂量能够逆转A549/DDP对DDP的耐药,逆转耐药倍数为3.45倍,与DDP(320μmol/L)合用,使DDP(320μmol/L)对A549/DDP细胞的抑制率由47.55%升高为73.32%,且q>1.15,表明金复康口服液与DDP合用有明显的协同增效作用,增加了DDP对A549/DDP细胞的敏感度;金复康口服液低剂量能够降低A549/DDP膜转运蛋白LRP、MRP的mRNA表达。结论:(1)低剂量金复康口服液与DDP合用能够增加DDP对A549/DDP的增殖抑制作用,二者具有显著的协同增效作用。(2)金复康口服液能够降低A549/DDP膜转运蛋白LRP、MRP的mRNA表达。金复康口服液可能通过降低耐药肿瘤细胞膜转运蛋白的表达而逆转肿瘤多药耐药,为扶正方药对化疗增效机理提供了新的实验依据。

补中益气汤与siRNA对肺腺癌A549/DDP细胞耐药逆转作用的比较

目的比较补中益气汤含药血清与siRNA技术(RNA)对人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP的耐药效果及对多药耐药蛋白P-gp表达的影响。方法制备补中益气汤含药血清,设计并合成针对P-gp基因对应序列的siRNA,转染A549/DDP细胞;实验分组为空白对照组、补中益气汤含药血清处理组、siRNA处理组,利用RT-PCR检测P-gp mRNA,Western印迹及免疫细胞化学法检测P-gp蛋白质的表达;MTT法检测A549/DDP细胞耐药逆转效果。结果补中益气汤含药血清和siRNA均能降低P-gp mRNA和蛋白质表达,恢复顺铂敏感性,耐药倍数分别降至2.01、2.73,具有统计学意义(P<0.05)。结论补中益气汤含药血清和siRNA均能有效逆转人肺腺癌耐药细胞A549/DDP的多药耐药。

槐耳清膏对人肺腺癌A549/DDP细胞增殖的影响及顺铂耐药逆转作用

目的:探讨槐耳清膏对人肺腺癌A549细胞和A549/DDP细胞增殖的抑制影响及其顺铂耐药细胞A549/DDP的逆转作用。方法:以体外培养的人肺腺癌A549及A549/DDP细胞为实验模型,采用MTT法测定不同浓度槐耳清膏对A549细胞及A549/DDP细胞的增殖抑制率,并运用流式细胞术检测顺铂联合槐耳清膏对A549/DDP细胞的变化,以及增敏作用效应。结果:槐耳清膏对A549细胞及A549/DDP细胞的增殖有明显抑制作用,随着药物浓度的增加,其抑制率逐渐增加,具有明显的量-效关系(P<0.05)。顺铂40μmol/L作用于A549及A549/DDP细胞48 h后,其凋亡率分别为(27.61±3.45)%和(17.93±1.73)%,两组间有统计学差异(P<0.01)。槐耳清膏1 mg/m L作用于人肺腺癌A549和A549/DDP细胞40 h后,再以相同浓度顺铂诱导,A549细胞凋亡率为(32.35±2.68)%,A549/DDP细胞凋亡率为(30.01±3.65)%,两组间无统计学意义,但与单独DDP作用相比,差异具有显著意义(P<0.01)。结论:槐耳清膏能显著抑制人肺腺癌A549及A549/DDP细胞的增殖,诱导细胞凋亡,还可以增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。

抑制Src酪氨酸激酶活性对人肺癌A549/DDP细胞耐药性及MDR1和LRP表达的影响

背景与目的本研究旨在探讨抑制Src酪氨酸激酶活性对人肺癌A549/DDP细胞耐药性及多药耐药蛋白(muti-drug resistance1,MDR1)和肺耐药相关蛋白(lungresistance-related protein,LRP)表达的影响。方法以Src酪氨酸激酶抑制剂作用于A549/DDP细胞,应用Western blot法检测肿瘤细胞Src酪氨酸激活性的变化,CellTiter-Glo发光法检测肿瘤细胞药物敏感性的变化,流式细胞仪检测肿瘤细胞Rh-123含量变化,Western blot法和RT-PCR检测肿瘤细胞MDR1和LRP表达变化。结果 Src酪氨酸激酶抑制剂可下调A549/DDP细胞中Src酪氨酸激活性,2.5M和10MSrc酪氨酸激酶抑制剂作用肿瘤细胞后,肿瘤细胞药物敏感性提高,逆转倍数(reversal fold,RF)分别为1.59倍和2.10倍,肿瘤细胞中Rh-123含量分别提高了1.21倍和1.59倍,MDR1mRNA表达分别是对照组的53.8%和27.5%,LRPmRNA表达分别是对照组的59.3%和21.4%,MDR1和LRP蛋白表达水平明显下降。结论抑制A549/DDP细胞中Src酪氨酸激酶活性可逆转肿瘤细胞多药耐药性,提高肿瘤细胞药物敏感性,其机制可能与降低细胞MDR1和LRP表达有关。

shRNA干扰沉默ERCC1对A549/DDP细胞增殖与凋亡的影响

目的前期研究发现ERCC1基因可能参与顺铂继发耐药,文中旨在探讨短发夹RNA(shRNA)靶向沉默切除修复交叉互补基因组1(ERCC1)对不同浓度顺铂处理的肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP增殖和凋亡的影响。方法实验分为阴性对照组(shRNA)、空白对照组(lipofectamine 2000)、ERCC1-shRNA1组(ERCC1-shRNA1)、ERCC1-shRNA2组(ERCC1-shRNA2)。设计并合成靶向人的ERCC1基因shRNA1、shRNA2;采用脂质体lipofectamine 2000转染入A549/DDP细胞,通过Real-time PCR和Western blot分别检测转染前后ERCC1 mRNA和蛋白表达;MTT法检测转染后各组细胞增殖抑制率的变化;流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果成功构建ERCC1-shRNA并转入A549/DDP,ERCC1-shRNA1组、ERCC1-shRNA2组mRNA表达量[(0.20±0.04)、(0.47±0.28)]明显低于阴性对照组和空白对照组[(0.96±0.12)、(0.84±0.07)],差异均有统计学意义(P<0.01)。ERCC1-shRNA1组、ERCC1-shRNA2组蛋白表达量[(0.24±0.10)、(0.37±0.11)]明显低于阴性对照组和空白对照组[(1.32±0.13)、(1.45±0.23)],差异均有统计学意义(P<0.01)。ERCC1-shRNA1组IC50值[(7.78±0.54)]明显低于阴性对照组和空白对照组[(16.71±2.33)、(16.69±1.69)],差异均有统计学意义(P<0.01)。ERCC1-shRNA1组处于G0/G1期细胞比例[(82.99±4.23)%]较阴性对照组、空白对照组[(72.87±3.23)%、(71.75±4.56)%]明显增高,细胞周期阻滞于G0/G1期,差异有统计学意义(P<0.05)。6.25、12.5μg/mL顺铂作用后ERCC1-shRNA1组细胞凋亡率[(11.91±1.41)%、(29.97±3.14)%]较0μg/mL顺铂作用下[(8.17±0.67)%]明显升高(P<0.05)。结论 ERCC1-shRNA能有效沉默A549/DDP细胞中ERCC1基因的表达,细胞增殖显著受抑而凋亡明显增强。

补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞药物泵P-gp及LRP蛋白表达的影响

目的:用补中益气汤含药血清处理A549/DDP细胞,观测药物泵P-gp及LRP的表达,并同小干扰RNA片段(siRNA)靶向切除P-gp、LRP基因后对这两种蛋白表达的影响相比较.方法:补中益气汤含药血清处理A549/DDP细胞,设计并合成针对P-gp、LRP基因对应序列的siRNA,采用转染试剂对细胞进行转染.两种蛋白实验分组均为:空白对照组、含药血清处理组及siRNA处理组.采用RT-PCR检测P-gp及LRP mRNA,免疫细胞化学法检测蛋白表达及定位,WB检测蛋白表达.结果:补中益气汤含药血清可以降低两种药物泵的表达,效果同siRNA类似,具有统计学差异(P<0.05).结论:补中益气汤含药血清能降低A549/DDP细胞上P-gp和LRP的表达.