靶向CK1α基因shRNA表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

通过RNA干扰实验沉默酪蛋白激酶1α(Casein Kinase1α,CK1α)基因,探讨其对肺癌细胞A549生长增殖的影响.首先构建3个针对CK1α基因不同位点的短发夹表达载体pGenesil-CK1α-S1、pGenesil-CK1α-S2、pGen-esil-CK1α-S3和一个无义错配载体pGenesil-NK,分别转染A549细胞,用G418筛选出阳性克隆,得到A549-S1、A549-S2、A549-S3及A549-NK细胞株.再通过RT-PCR和W estern b lotting方法,分别检测了CK1α基因的mRNA和蛋白的表达情况.比对A549-NK,A549-S1、A549-S2及A549-S3 mRNA水平的抑制率分别为84.3%、57.9%和61.8%(P<0.001);蛋白质水平的抑制率分别为78.4%、51.3%和59.9%(P<0.001).选择干扰效率较好的A549-S1细胞进行后续实验.细胞计数绘制生长曲线、CCK-8法观察细胞增殖状况和流式细胞仪检测细胞所处周期时相来分析转染CK1α基因shRNA表达载体对A549细胞生长增殖的影响.实验结果显示,A549-S1与A549和A549-NK两对照组的平均值比较,细胞计数抑制率为(37.7±2.2)%(P<0.01);CCK-8抑制率为(26.2±1.5)%(P<0.05);S期减少(75.0±4.0)%(P<0.01);G2/M期减少(45.2±5.4)%(P<0.05).因此,转染CK1α基因shRNA表达载体可导致CK1α基因的沉默,明显抑制A549细胞的生长和增殖.

RNA沉默HMGN5基因对肺癌A549细胞增殖的影响及意义

目的通过RNA干扰技术(RNAi)沉默HMGN5基因,探讨其对肺癌A549细胞增殖的影响。方法培养人肺癌A549细胞株,HMGN5基因合成慢病毒载体感染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测A549细胞中HMGN5沉默率;设阴性对照组及RNA干扰组,MTT法检测A549细胞的增殖能力;Brdu法检测沉默HMGN5的表达;流式细胞仪检测其细胞周期。结果与对照组比较,RNA干扰组HMGN5基因的mRNA及蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05);A549细胞的增殖能力明显下降,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);细胞增殖率为29.70%,较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05);G1期细胞为53.50±0.30,高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用RNAi能够沉默HMGN5基因,人肺癌A549细胞增殖能力显著降低,HMGN5基因可能参与肺癌的发生、发展、增殖过程。

RNA干扰her2／neu基因表达抑制肺癌A549细胞增殖的研究

目的:HER2/neu表达对肺癌细胞生物学的影响尚不明了,文中运用RNA干扰技术抑制HER2/neu表达,并观察对肺癌A549细胞体外增殖的影响。方法:构建针对her2/neu基因的RNA干扰真核表达载体,运用脂质体介导转染A549细胞并用G418筛选出阳性克隆株;半定量RT-PCR和Western检测转染后HER2/neu mRNA及蛋白的表达水平;FCM检测细胞周期分布;MTT法绘制细胞生长曲线观察体外细胞的增值能力。结果:成功构建针对her2/neu基因的RNA干扰真核表达载体(命名为psilence3.1-HER2),转染后使A549细胞HER2/neu mRNA和蛋白的表达较未转染组和阴性对照质粒转染组均显著下调;细胞G0/G1期细胞增加,S期细胞减少;细胞生长曲线右移、增殖速度明显减慢。结论:psilence3.1-HER2能够稳定、高效、特异地抑制肺癌A549内her2/neu基因的表达,可显著抑制细胞增殖。针对her2/neu基因的RNAi策略有望成为肺癌的基因治疗的新选择。

沉默人肺癌A549细胞中期因子基因表达对细胞凋亡的影响

目的研究RNA干扰(RNAi)人肺癌A549细胞中期因子(MK)基因表达及对肿瘤细胞凋亡的影响。方法构建含MK siRNA真核表达载体,将其转染到人肺癌A549细胞株中(实验组),另有阴性对照组(转染阴性对照质粒)和空白对照组。应用RT-PCR的方法检测各组细胞中MK mRNA的表达情况;采用Western blot法检测MK蛋白的表达情况;用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果实验组MK蛋白和mRNA表达都下降,分别下降了89.3%和83.3%。转染实验组A549细胞有自发性凋亡的发生,早期凋亡比阴性对照组和空白组分别提高了15.5倍和9.34倍。实验组caspase-3活性明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。结论 RNAi下调人肺癌A549细胞株MK的表达,可诱导肿瘤细胞的自身凋亡。

SiRNA抑制高氧暴露下A549细胞硫氧还蛋白-2表达及其与肺细胞代谢和凋亡的关系

目的研究小分子干扰RNA(SiRNA)抑制高氧暴露下人肺腺癌A549细胞硫氧还蛋白-2(Trx-2)表达及其与肺细胞代谢和凋亡的关系,探讨高氧肺损伤的发病机制和防治措施。方法体外传代培养A549细胞系,待其生长至接近亚汇合状态时,将体外化学合成Trx-2序列特异性的SiRNA通过Lipofectamine2000转染A549细胞。将细胞随机分为无干扰空气组、无干扰高氧组、干扰后空气组、干扰后高氧组4组。高氧组持续暴露于常压高浓度氧(92%O2,5%CO2)中;空气组仍置于5%CO2培养箱中。4组分别于高氧或空气暴露12、24、48 h提取A549细胞总RNA。采用半定量RT-PCR测定Trx-2、三磷酸腺苷合成酶6,8(ATPase 6、8)及细胞色素C(CytC)mRNA的表达;Western-blot检测Trx-2蛋白表达;流式细胞术检测高氧和沉默Trx-2对A549细胞凋亡的影响。结果序列特异性SiRNA可抑制Trx-2表达,SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3 3组Trx-2蛋白表达均受到抑制,SiRNA-1组抑制效率最高(79.51%)。与无干扰空气组相比,无干扰高氧组12 h CytC和24 h Trx-2 mRNA的表达增高,48 h CytC mRNA的表达降低(P<0.05)。与干扰后空气组相比,干扰后高氧组24、48 h Trx-2 mRNA的表达减弱,但在12、24 h CytC mRNA表达水平升高(P<0.05)。与无干扰空气组相比,无干扰高氧组12、48 hATPase 6 mRNA的表达增高,24、48 h ATPase 8 mRNA的表达增高(P<0.05)。与干扰后空气组相比,干扰后高氧组24、48 h ATPase 6,8 mRNA的表达减弱(P<0.05)。干扰后高氧组24、48 h A549细胞凋亡百分数明显高于干扰后空气组(P<0.05)。结论高氧暴露和沉默Trx-2导致A549细胞ATPase 6,8表达下调和CytC表达升高,表明能量代谢障碍和细胞凋亡参与高氧肺损伤发病过程,Trx-2对高氧肺损伤线粒体起重要的保护作用。

Survivi n-si RNA抑制肺癌A549细胞的增殖并增强其对顺铂的敏感性

目的:构建靶向存活素(survivin)的干扰RNA(siRNA)质粒,观察其对A549细胞增殖、凋亡以及顺铂敏感性的影响。方法:应用pSilencer-U6质粒构建survivin-siRNA干扰质粒,RT-PCR和Western blotting检测survivin mRNA和蛋白的表达,DAPI染色法检测细胞的凋亡,MTT法检测细胞的增殖。结果:成功构建了survivin-siRNA干扰质粒。Survivin-siRNA质粒转染可明显下调A549细胞中survivin mRNA和蛋白的表达、抑制A549细胞的增殖、促进细胞的凋亡、增强A549细胞对顺铂的敏感性。结论:Survivin-siRNA沉默survivin在肺癌细胞中的表达能够抑制肿瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡,并能增强肿瘤细胞对化疗药物顺铂的敏感性,survivin可作为肺癌治疗的潜在靶点。

小干扰RNA特异性抑制肺肿瘤细胞A549中绿色荧光蛋白基因表达

目的 :探讨绿色荧光蛋白 (greenfluorescenceprotein ,GFP)特异的小干扰RNA (smallinterferenceRNA ,siRNA)对肺肿瘤细胞A5 4 9中的GFP基因表达的抑制作用 ,建立以真核表达载体释放生成特异基因siRNA的方法。方法 :构建mU6启动子驱动的含有GFP特异siRNA的真核表达质粒 ,转染A5 4 9肺肿瘤细胞 ,观察共转染时不同剂量siRNA对GFP的抑制效应。结果 :针对GFP核酸序列设计的特异性siRNAGFP siRNA可有效抑制其表达 ,并当比例为 1∶1时效果最佳 ,而空质粒载体及无关RNAi无此效应。结论 :以mU6为启动子的含特异RNAi的质粒可作为抑制特异基因表达的一种新的技术手段 ,并且为研究基因功能的一条有效途径。

PM2.5刺激非小细胞肺癌A549细胞凋亡基因的表达

目的观察PM2.5暴露对非小细胞肺癌A549细胞的影响,进而了解其对细胞的毒性作用机制。方法利用细胞活力检测法确定PM2.5暴露的浓度;用透射电镜观察暴露后细胞的形态特征;通过转录组测序及实时定量RT-PCR,对损伤发生机制进行预测。结果通过细胞活力检测确定PM2.5暴露处理的终浓度为50μg/cm2。形态学检测表明,暴露处理后,细胞核内染色质凝聚,边集于核膜。凋亡相关基因IL1A、IL1B、CXCL3、CXCL2、PTGS2、IRAK2的表达上调,TP53和TNFRSF1A的表达下调。结论通过刺激细胞凋亡基因表达水平的变化,PM2.5暴露诱导了非小细胞肺癌A549细胞的凋亡。

HIF-1α介导了间歇低氧对人肺腺癌A549细胞体外生物学行为的影响

目的:探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是否介导间歇低氧对人肺腺癌A549细胞体外活力、凋亡以及侵袭的影响。方法:采用体外转染方法将特异性针对HIF-1α的siRNA导入A549细胞,在间歇低氧条件下培养后通过real-time PCR和Western blot法检测HIF-1α及其下游Bcl-2、Bax、P53、P21、VEGF的mRNA和蛋白表达;通过MTT法和流式细胞术分别检测A549细胞的活力、凋亡及细胞周期;通过Transwell小室检测A549细胞的侵袭能力。结果:未转染HIF-1α-siRNA的A549细胞[间歇低氧空白对照组(IHC组)、间歇低氧空载体对照组(IHE组)及间歇低氧阴性对照组(IHN组)]经间歇低氧干预后的HIF-1α、Bcl-2及VEGF表达均明显高于常氧对照组(RA组),Bax及P21表达均明显低于RA组(P<0.05),而转染HIF-1α-siRNA的A549细胞[间歇低氧siRNA组(IHS组)]较IHC组、IHE组及IHN组经间歇低氧干预后的HIF-1α、BCL-2及VEGF表达均明显下调,Bax及P21表达较均明显上调(P<0.05);所有间歇低氧组A549细胞的P53表达均较RA组升高(P<0.05),但各间歇低氧组之间无显著性差异。IHC组、IHE组及IHN组A549细胞经间歇低氧干预后较RA组的细胞活力增强,凋亡率下降,侵袭力增强(P<0.05),而IHS组A549细胞经间歇低氧干预后细胞周期被阻滞于G1期,较未转染组的细胞活力下降,凋亡增加,侵袭能力下降(P<0.05)。结论:间歇低氧可通过HIF-1α途径调控其下游基因表达进而促进A549细胞的活力和转移;通过RNA干扰技术造成HIF-1α基因沉默可以抑制间歇低氧引起的A549细胞生长和转移。

siRNA靶向沉默Lipocalin-2基因增加人肺癌A549细胞对顺铂的敏感性

目的利用针对Lipocalin-2的小干扰RNA(siRNA)沉默人肺癌A549细胞中Lipocalin-2基因表达,观察其对顺铂化疗敏感性的影响。方法分别采用免疫组织化学SP法和Western blot检测Lipocalin-2在肺癌组织和3种肺癌细胞株(A549、NCI-H661、NCI-H446)中的表达情况。设计并构建靶向Lipocalin-2的siRNA转染A549细胞,采用Real-time PCR和Western blot检测转染效率。MTT法检测顺铂处理后细胞存活率及半数抑制浓度(IC50)。流式细胞术检测顺铂处理后细胞凋亡率。结果 Lipocalin-2蛋白在肺癌组织和肺癌A549、NCI-H661、NCI-H446细胞中均异常高表达(P<0.05)。siRNA-Lipocalin-2转染A549细胞能在mRNA和蛋白水平显著抑制Lipocalin-2表达,同时顺铂诱导的细胞存活率显著降低,凋亡率显著增高(P<0.05)。结论利用特异性siRNA能有效抑制人肺癌A549细胞中Lipocalin-2 mRNA和蛋白表达,增强细胞对顺铂的敏感性。

HLCDG1基因siRNA表达质粒的构建及其对A549细胞周期和增殖的影响

目的:本研究旨在应用RNA干扰技术,诱导转基因肺癌细胞HLCDG1基因沉默并观察其对肺癌细胞周期和增殖的影响。方法:构建HLCDG1基因短小干扰双链RNA表达载体,筛选HLCDG1基因表达沉默的肺癌细胞株并应用MTT和流式细胞仪分析这一肺癌细胞株增殖和细胞周期分布状况。结果:根据siRNA表达载体的设计原则,构建了能在哺乳动物细胞稳定表达的siRNA载体5个(4个位点匹配实验组和1个位点错配对照组),依次命名为pHL-si-1、pHL-si-2、pHL-si-3、pHL-si-4和pHL-si-c。上述载体分别与表达HLCDG1的重组体pcDNA3.1(+)/HLCDG1共转染A549细胞,筛选到一株共转染pHL-si-1载体和pcDNA3.1(+)/HLCDG1重组体的A549细胞,它几无HLCDG1基因表达,这株细胞暂命名为A549-HLCDG1-si-1。MTT和流式细胞仪分析表明,A549-HLCDG1-si-1细胞增殖能力明显提高,进入S期和G2+M期增多,滞留G1期减少。结论:采用RNAi技术特异阻断HLCDG1基因表达,验证了HLCDG1基因对A549肺癌细胞有生长抑制作用。

RNAi技术对A549细胞survivin基因表达及顺铂敏感性的影响

目的利用RNA干扰(RNAi)技术沉默抗凋亡基因survivin,观察其对人肺腺癌细胞A549增殖以及顺铂药物敏感性的影响。方法将靶向survivin的基因片段插入到载体后构建重组质粒,将其导入A549细胞,RT-PCR及免疫荧光法分析转染前后A549细胞survivin mRNA及蛋白的表达情况,MTT法检测转染后A549细胞对顺铂的敏感性变化。结果成功构建pGenesil1.1-survivin重组质粒。转染重组质粒后,A549细胞survivin mRNA和蛋白的表达明显降低;转染前顺铂对A549细胞的IC50明显高于转染后(P<0.05)。结论靶向survivin的RNAi表达载体能下调survivin基因表达,增强顺铂对A549细胞的药物敏感性。

阻断Notch信号途径能有效抑制A549细胞增殖

目的 Delta-like 4(DLL4)是Notch信号通路的配体之一,是近年新发现的血管生长调控因子,研究表明DLL4的高表达与肺腺癌转移预后密切相关。该文旨在研究DLL4在A549细胞中的表达,以及DLL4基因表达对人A549细胞增殖与凋亡的影响。方法 (1)体外培养A549细胞,免疫细胞化学法检测DLL4在A549细胞中的表达及定位;(2)设计并化学合成靶向DLL4基因的siRNA序列,lipofectamineTM2000介导DLL4 siRNA转染A549细胞,RT-PCR进行DLL4-mRNA定量,Western blot分别检测A549细胞DLL4蛋白的改变;(3)四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞的存活和生长变化;(4)激光共聚焦显微镜检测Annexin V-FITC标记的A549细胞的细胞凋亡比率。结果 (1)A549细胞表达DLL4蛋白,且定位于胞浆中;(2)DLL4-mRNA和DLL4蛋白的表达在对照组与干扰组之间有显著差异(P<0.05);(3)MTT检测显示抑制DLL4表达对A549细胞的增殖有抑制作用,DLL4干扰组细胞增殖抑制率为43.85%,未处理组细胞增殖抑制率为23.81%;(4)抑制DLL4基因表达,A549细胞的凋亡比率明显升高,DLL4干扰组细胞凋亡率为(25.01±4.32)%,未处理组细胞凋亡率为(14.24±0.98)%。结论 DLL4在A549细胞表达。特异性阻断DLL4/Notch信号途径能有效抑制A549细胞增殖,促进细胞凋亡。

厄洛替尼联合靶向生存素的小干扰RNA对人肺腺癌A549细胞的生长抑制作用

目的探讨体外转染靶向生存素的小干扰RNA(siRNA)是否能够增强厄洛替尼对肺腺癌细胞的增殖抑制、凋亡诱导作用,以及厄洛替尼是否能够抑制肺腺癌细胞生存素基因的表达,并探讨其体外作用机制。方法体外培养人肺腺癌A549细胞,转染靶向生存素的siRNA和厄洛替尼两种处理因素单独或联合应用于A549细胞,流式细胞技术检测各组A549细胞早期凋亡情况;噻唑蓝比色法检测A549细胞增殖抑制情况;免疫细胞化学染色法观察各组A549细胞生存素蛋白表达的变化;免疫蛋白印迹法检测各组A549细胞生存素蛋白表达水平。结果生存素siRNA转染和厄洛替尼两者单独或联合应用于人肺腺癌.A549细胞作用48 h后,A549细胞的早期凋亡率均明显增加,都对细胞增殖有明显的抑制作用,并能降低细胞内生存素蛋白的表达水平,与空白对照组比较差别有统计学意义(P<0.05),两者联合应用较单独应用对A549细胞增殖的抑制作用更显著、早期凋亡更明显、对生存素蛋白表达的抑制作用更强(均P<0.05)。结论应用siRNA沉默生存素表达是提高体外厄洛替尼对人肺腺癌A549细胞增殖抑制、凋亡诱导及生存素蛋白表达抑制作用的有效途径。

RNAi抑制Layilin表达对肺腺癌A549细胞体外侵袭和荷瘤鼠体内淋巴转移的影响

背景与目的:透明质酸参与了多种肿瘤细胞的侵袭行为,Layilin是一种新发现的特异性透明质酸受体。本研究在发现Layilin表达于人肺腺癌A549细胞株的前期工作基础上,观察用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制Layilin表达后,对人肺腺癌A549细胞体外侵袭和体内淋巴道转移的影响。方法:构建能表达针对Layilin的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的RNAi质粒(Layilin siRNA plasmid)和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNAi质粒(control siRNA plasmid),分别转染A549细胞,新霉素抗性筛选得到Layilin表达受抑制的A549-siLayilin细胞和Layilin表达未受影响的A549-siControl细胞。针对非转染(A549-nontransfec-tion)、A549-siLayilin、A549-siControl 3组细胞,分别采用RT-Real time PCR和Western blot技术检测Layilin表达,用Boyden小室实验检测细胞体外侵袭能力,用爪垫皮下种植淋巴结转移模型检测淋巴转移能力。结果:与A549-non-transfection组和A549-siControl组相比,A549-siLayilin组细胞Layilin表达减少,体外侵袭能力降低,体内淋巴转移率下降。结论:通过RNAi抑制Layilin表达后,能有效抑制透明质酸所诱导的A549细胞体外侵袭和裸鼠移植瘤淋巴转移。本研究为通过RNAi手段抑制Layilin表达,进而抑制肺腺癌淋巴转移提供了有益的思路。

TNF-α基因siRNA真核表达载体的构建及其对A549细胞TNF-α和TGF-β1表达的影响

目的:构建靶向肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,观察其对人肺腺癌A549细胞中TNF-α和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法:依据GenBank中人TNF-α(NM_000594)序列和siRNA靶序列设计原则,设计并合成一对针对TNF-α的特异性序列(siTNF-α)和一对无关序列(siCon)。退火合成DNA双链,再分别重组入pRNAT-U6.1载体,经过PCR和DNA测序鉴定。将构建好的重组载体pRNAT-U6.1-siTNF-α、pRNAT-U6.1-siCon及空载体pRNAT-U6.1用脂质体介导转染A549细胞株,分别采用RealtimePCR和Westernblot方法检测细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平。结果:PCR和DNA测序鉴定证实载体构建成功;转染pRNAT-U6.1-siTNF-α的A549细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白表达水平均低于其他3组(FmRNA=478.663,4.081;F蛋白=123.420,6.312,P均<0.05)。结论:成功构建了靶向TNF-α基因的siRNA真核表达载体,该载体能够有效沉默A549细胞中TNF-α的表达,TGF-β1基因表达亦受到抑制。

RNA干扰沉默NS基因对人非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究RNA干扰沉默核干细胞因子(nucleostemin,NS)基因表达对人肺腺癌A549细胞株增殖和凋亡的影响。方法:向A549细胞内分别转染靶向NS基因的siRNA表达载体pcDNA4/C-NS-silencer和空载体pcDNA4/C vector作为silencer组和vector组,以不转染质粒的A549细胞为normal组,Real-time PCR检测转染pcDNA4/C-NS-silencer对A549细胞内NS基因表达的影响。CCK-8法检测沉默NS基因对A549细胞增殖的影响,流式细胞术检测对细胞周期的影响,Hoechst33258核染色法和流式细胞术检测对细胞凋亡的影响。结果:Silencer组NS基因表达较vector组和normal组明显被抑制(0.166±0.024 vs 0.497±0.022、0.505±0.032,均P<0.01);Silencer组A549细胞增殖活性显著低于vector组和normal组(0.518±0.107 vs 0.855±0.102、0.832±0.158,均P<0.05);Silencer组A549细胞周期阻滞于G0/G1期;Silencer组细胞核皱缩呈致密浓染,染色质碎裂呈块状并有边集现象,且细胞凋亡率较vector组与normal组显著增高[(34.80±6.77)%vs(9.70±1.50)%,(8.16±2.01)%,P<0.01]。结论:RNA干扰沉默NS基因可抑制人肺腺癌A549细胞的增殖,促进细胞凋亡。

针对layilin的shRNA抑制透明质酸诱导人肺腺癌A549细胞体外黏附和侵袭

背景与目的透明质酸参与了多种肿瘤细胞黏附侵袭行为。layilin是一种新发现的与细胞骨架有密切联系的透明质酸受体。本研究的目的是观察针对layilin的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)对体外培养的人肺腺癌A549细胞layilin表达及受透明质酸诱导黏附侵袭行为的影响。方法设计和构建带有U6启动子的能产生针对layilin的shRNA的RNA干扰质粒,转染至A549细胞,以RT-PCR、Westernblot和免疫荧光检测A549细胞转染前后layilin表达,以平板黏附模型和Boyden小室模型检测A549细胞转染前后黏附和侵袭能力。结果和转染前相比,转染了RNA干扰表达质粒的A549细胞layilin表达明显减少(P<0.01),而且受透明质酸诱导而黏附于平板和穿过Boyden小室隔膜的A549细胞数皆明显减少(P<0.01)。结论针对layilin的shRNA能明显抑制透明质酸诱导的人肺腺癌A549细胞体外黏附和侵袭能力。

RNA干扰抑制Snail表达对A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭的影响

目的:研究用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制转录因子Snail表达后,对人肺腺癌A549细胞上皮-间充质转分化表型和体外侵袭能力的影响。方法:构建能表达针对Snail的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)的RNA干扰载体(Snail siRNA vector)和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNA干扰载体(control siRNA vector),分别转染A549细胞,新霉素抗性筛选得到Snail表达受抑制的A549-siSnail细胞和Snail表达未受影响的A549-siControl细胞。针对非转染(A549-nontransfection)、A549-siSnail、A549-siControl三组细胞,分别采用RT-PCR和Western blot技术检测Snail、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙粘素表达,用Boyden chamber模型检测细胞侵袭能力。结果:A549-nontransfection组:Snail和α-SMA表达强阳性,E-钙粘素表达弱阳性;A549-siSnail组:和A549-nontransfection组相比,Snail和α-SMA表达显著减弱(P<0.01),E-钙粘素表达显著增强(P<0.01),Boyden chamber穿膜细胞数显著减少(P<0.01);A549-siControl组:Snail、α-SMA和E-钙粘素表达,及Boyden chamber穿膜细胞数皆和A549-nontransfection组无显著差异(P>0.05)。结论:通过RNA干扰阻滞Snail表达能有效地抑制A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭能力。Snail可能在肺腺癌上皮-间充质转分化及侵袭过程中扮演重要角色,抑制Snail表达可能成肺腺癌治疗的可行策略。

Polo-like激酶1反义RNA对肺癌细胞A549细胞周期的影响

背景与目的Polo-Like激酶1(Polo-likekinase 1,Plk1)是参与有丝分裂调控的重要分子,已在肺腺癌细胞株A549中检测到Plk1的高表达,并认为Plk1高表达与肺癌患者的放化疗耐受和预后相关。本研究利用反义RNA技术,探讨Plk1基因表达下调对肺癌细胞细胞周期的影响。方法培养肺腺癌细胞株A549,构建表达Plk1反义RNA的质粒pcDNA3.0-Plk1(pc3.0P),通过脂质体介导转入A549细胞,Westernblot、RT-PCR检测Plk1的表达,BrdU脉冲标记和流式细胞术分析细胞周期变化;免疫荧光染色检测α微管蛋白的表达。结果A549细胞转染pc3.0P后,Plk1mRNA的表达较对照组显著下降(P<0.05),转染24h后Plk1mRNA的表达下降46.75%,转染48h后下降61.84%;蛋白表达亦有下降;S期细胞百分数(BrdU标记指数)较对照组明显下降(P<0.05),转染后48h仅有25.59%;转染后72h出现G2/M期阻滞(P<0.05),并出现细胞凋亡;微管染色显示细胞周边缺乏微管的聚集,单极纺锤体形成。结论Plk1影响纺锤体微管的形成,使A549细胞增殖速度减慢,细胞周期阻滞并发生凋亡。