靶向AATF基因shRNA表达载体的构建及其稳定表达的白血病U937细胞系的建立

本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系。根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303～324、443～464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer 3.1人H1启动子干扰载体中,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确,经电穿孔将3个重组载体(pSA-1、pSA-2、pSA-3)转染人白血病U937细胞系,G418(500 mg/L)有限稀释法持续筛选8周后,扩增获得稳定表达的细胞系;RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达。结果表明,AATF干扰序列及读码框完全正确。稳定转染细胞AATF mRNA表达下调,AATF蛋白表达量下降(P<0.05)。结论:成功地构建AATF shRNA真核表达载体及AATF表达稳定抑制的白血病U937细胞系,为以AATF基因为靶点的人白血病进一步研究奠定了实验基础。

AATF-Che1超家族基因原核表达及其融合蛋白纯化

目的 体外构建抗凋亡转录因子（AATF）-Che1重组蛋白原核表达载体pGEx-4T-1-AATF-Che1,优化pGEX-4T-1-AATF-Che1重组载体原核诱导表达条件,并获得可溶性的纯化谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白.方法 采用聚合酶链反应（PCR）法从pGEX-4T-1-AATF重组质粒扩增出AATF-Che1基因,将其与原核表达载体pGEX-4T-1双酶切后,回收目的基因片段.通过T4连接酶定向连接AATF-Che1基因和线性化原核表达载体pGEX-4T-1,获得重组蛋白AATF-Che1原核表达质粒pGEX-4T-1-AATF-Che1.将构建正确的表达质粒转化入大肠埃希菌感受态细胞BL21,并采用诱导剂异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白AATF-Che1的表达.考察不同诱导剂IPTG浓度、诱导时间和诱导温度对重组蛋白表达量及表达方式的影响,从而对诱导条件进行优化.采用谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠对可溶形式的GST融合蛋白进行纯化,并采用Western蛋白免疫印记（WB）法鉴定获得的纯化蛋白.结果 原核表达质粒pGEX-4T-1-AATF-Che1的酶切、PCR鉴定结果及测序结果均正确;IPTG诱导蛋白在约65 kD处出现了1条新的蛋白条带,即AATF-Che1与GST的融合蛋白.不同的诱导时间及不同的IPTG浓度条件下,诱导融合蛋白的量均未见明显变化;37℃诱导时,重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,而16℃诱导时,融合蛋白可溶性地存在于上清液中.最终成功获得AATF-Che1可溶性纯化的融合蛋白,且WB法鉴定其抗原性良好.结论 体外成功构建AATF-Che1基因重组蛋白原核表达载体pGEX-4T-1-AATF-Che1,寻找到优化的重组载体原核诱导表达条件,并获得了大量可溶形式纯化的GST融合蛋白,为进一步研究AATF-Che1超家族基因在肿瘤中的作用奠定了基础.

拮抗凋亡转录因子与乳腺癌遗传易感性的关系

目的通过突变分析,探讨拮抗凋亡转录因子(AATF)与乳腺癌遗传易感性之间可能存在的关联。方法使用构象敏感凝胶电泳(CSGE)和直接测序技术对89例收治的家族性乳腺癌患者完整的AATF基因编码区进行分析。以210例匿名的非癌症患者血样作为对照,对突变频率进行评估。结果共发现7个变异位点,其中6个位于内含子,另外1个为位于外显子的错义突变,对它们在患者和健康对照个体中出现的频率进行比较,未发现致病性倾向。结论本研究89例家族性乳腺癌患者AATF基因的突变分析结果未能提供充分证据表明它们与乳腺癌遗传易感性之间存在关联。

拮抗凋亡转录因子与肿瘤增殖及凋亡

肿瘤是目前临床常见的疾病之一。肿瘤的经典治疗方式主要包括手术切除、放疗和化疗。近年来肿瘤治疗的手段不断发展,但许多进展期的肿瘤仍然未见较有效的治疗方式,因此亟需新的治疗手段。肿瘤细胞的特点是具有无限增殖和抵抗凋亡的能力。因此,鉴定参与肿瘤细胞增殖和凋亡的基因将为肿瘤治疗提供潜在的靶点。拮抗凋亡转录因子(apoptosis-antagonizing transcription factor,AATF),又称Che-1,最早发现能与RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ,polⅡ)的核心亚基hRPB11(human RNA polymeraseⅡ(polⅡ)subunit)和视网膜母细胞瘤易感基因(retinoblastoma susceptibility gene,Rb)相互作用,并抑制Rb的生长抑制功能。现又发现,Che-1能与RNA聚合酶I(RNA polymeraseⅠ,polⅠ)结合,进而促进RNA聚合酶I依赖的转录,影响核糖体合成。在细胞应激下,Che-1的定位、稳定性受到翻译后修饰(post-translational modification,PTM)的调控。在肿瘤细胞应对DNA损伤、凋亡刺激及其他应激时,Che-1通过调控增殖和凋亡相关基因,进而调节肿瘤的发生发展。此外,Che-1的表达存在一个负反馈机制调节。本文拟对Che-1在肿瘤中作用的最新进展作一简要综述。

多聚聚合酶-1在氢醌诱导的DNA损伤应答中的作用及其机制

目的探讨多聚聚合酶-1(PARP-1)在氢醌(hydroquinone,HQ)诱导的DNA损伤应答中的作用及其相关的调控机制。方法以磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以10μmol/L HQ染毒TK6细胞为处理组,分别在染毒0.5、1、2、3、4、5和6 h时收集细胞,以0 h为对照组,或用HQ处理PARP-1沉默细胞,运用western bloting技术检测TK6细胞中磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)、聚腺苷二磷酸核糖(PAR)以及DNA损伤应答(DDR)相关蛋白PARP-1和抗凋亡转录因子(AATF)的表达情况。结果 HQ处理TK6细胞后,γ-H2AX的含量在3 h时达到高峰[(14.83±1.14)倍](P<0.05),此后逐渐下降;AATF的含量一直上升,6 h含量最高[(15.62±1.14)倍](P<0.05)。PARP-1的含量先下降后上升,3 h其含量最低[(0.66±0.04)倍](P<0.05)。PAR的含量在0.5 h达高峰[(1.78±0.13)倍](P<0.05),而后逐渐下降。PARP-1沉默细胞中,HQ处理使得PARP-1、PAR和AATF的含量分别降了77%(P<0.05)、64%(P<0.05)和68%(P<0.05),γ-H2AX的含量上升了1.65倍(P<0.05)。结论 PARP-1通过聚多聚腺苷二磷酸(ADP)核糖基化作用增强AATF稳定性参与由氢醌诱导的DNA损伤修复。