转录因子ABP9转化大豆(Glycine max L.)及遗传转化条件优化

【目的】将抗逆相关转录因子ABP9基因导入大豆(Glycine max L.)基因组,并对转化系统条件进行探索,为提高大豆遗传转化效率提供依据。【方法】以农杆菌介导的半种法大豆遗传转化系统为基础,对目的基因进行转化;以健康外植体获得率、抗性丛生芽获得率和抗性芽伸长比率为指标,对转化系统条件进行优化。【结果】共培养时保证充足的光照和氧气,外植体生长情况最好;在共培养或诱导丛生芽培养基中加入600mg·L-1的L-半胱氨酸可以使抗性丛生芽获得率由22.1%提高至32.6%;采用4种植物激素进行正交试验,诱导抗性芽伸长比率最高的激素配比为:6-BA为1.5mg·L-1,GA3为0.75mg·L-1,IAA为0.1mg·L-1,ZT为1.0mg·L-1。【结论】利用优化的方法进行遗传转化研究已获得转基因再生植株,经PCR和DNA测序等分子检测,证明目的基因ABP9已导入并整合到大豆基因组中;转化率为1.33%。

转录因子ABP9基因过表达对植物生长发育的影响分析

【研究目的】为分析玉米ABA/逆境响应转录因子ABP9基因过量表达对植物生长发育的影响以利用该基因开展抗逆分子育种。【方法】本研究构建了35S启动子驱动ABP9组成型表达的植物表达载体,获得了过表达ABP9基因的拟南芥转基因株系,并在正常生长条件下,比较了转基因植株和野生型在种子萌发、营养生长和生殖生长阶段的形态和生理变化,分析了可能的分子机制。【结果】结果表明,正常生长条件下,转基因植株与野生型相比表现出萌发,幼苗生长以及开花阶段的生长抑制;气孔开度减小,叶片内源ABA含量降低;ABA信号传导基因表达增强,而ABA合成基因表达降低;而且这些效应在ABP9基因表达相对较强的转基因株系中表现更明显。【结论】说明ABP9基因过量在正常生长条件下即诱导转基因植株产生耐逆反应,抑制植株的生长发育。因此,在利用ABP9基因进行转基因抗逆育种时须考虑控制ABP9基因适时适量表达。

转ABP9基因冬小麦的抗旱性评价

为了解转ABP9基因冬小麦材料的抗旱性,在雨养和灌溉条件下,对32份转ABP9冬小麦株系及其受体亲本石4185的主要农艺性状和抽穗期部分生理指标进行了测定,并采用隶属函数值法和抗旱性度量(D)值法对其抗旱性进行了综合评价,利用灰色关联度法对相关抗旱性状与抗旱指数之间的关联度进行了分析。结果表明,采用隶属函数值法和D值法评价时,分别有6和10份转基因小麦材料的抗旱性较受体亲本石4185增强。各农艺性状和生理指标依照与抗旱指数的关联度从高到低依次为单穗粒重、结实小穗数、千粒重、穗粒数、叶绿素含量、POD活性、MDA含量、SOD活性、株高、有效分蘖。因此,在对转ABP9基因抗旱小麦进行鉴定筛选时,应主要以单穗粒重、结实小穗数、千粒重、穗粒数等农艺性状作为参考,适当考虑生理指标的影响;由于不同指标或性状对小麦抗旱性的贡献不同,采用抗旱性度量值较平均隶属函数值进行抗旱性综合评价更为可靠。

抗逆转ABP9基因黑麦草和高羊茅植株的鉴定

选取黑麦草(Lolium perenne)barti和telstar品系以及高羊茅(Festuca elata)追寻者品系作为相应的受体材料,采用实验室克隆的玉米(Zea mays)抗逆相关转录因子ABP9通过农杆菌介导和基因枪轰击2种方法进行遗传转化,获得再生植株;并对再生植株进行PCR、Southern和Northern杂交分子检测以及抗逆性鉴定。试验结果表明,成功获得ABP9在基因组中整合并表达且抗逆性得到显著提高的转基因黑麦草和高羊茅植株。

转录因子ABP9基因在不同启动子驱动下对转基因拟南芥生长发育的影响

本研究构建了由IND(6xABRE-mini35S)和Pabp9启动子分别驱动ABP9基因的两种诱导型表达的植物表达载体,得到拟南芥转基因株系;并在正常生长的条件下,与转空载体pCHF3和转35S-ABP9的两种转基因株系在种子萌发、根系伸长、营养和生殖生长等方面进行比较,分析转录因子ABP9基因在不同启动子的驱动下,对转基因拟南芥各生长发育时期的影响。研究结果表明,在转基因拟南芥中,利用上述两种诱导型启动子驱动ABP9基因表达能够一定程度上的解除由组成型表达ABP9基因导致的生长延迟。

转基因ABP9玉米株系的耐盐性分析

旨为分析转基因ABP9玉米的耐盐性,并进一步研究玉米耐盐的分子调控机制。通过对转基因ABP9玉米植株进行PCR、Southern blot和qRT-PCR分析鉴定;采用Hoagland营养液水培法,对转ABP9基因玉米及非转基因对照进行NaCl胁迫处理,分析二者在幼苗期的生理指标和基因表达差异。结果表明,转入的ABP9以单拷贝整合到基因组中,且能较高表达。与非转基因对照相比,转基因玉米幼苗NaCl胁迫下的叶绿素含量、Fv/Fm、渗透调节物质和抗氧化酶活性,以及盐胁迫后恢复过程中的叶片相对含水量均显著提高;而其丙二醛含量、相对电导率均显著降低。转录组测序和qRT-PCR分析显示,一系列盐胁迫应答基因在转基因玉米植株中上调表达。转入ABP9的增强表达提高了转基因玉米的耐盐能力。

玉米转ABP9基因植株的获得

ABP9参与ABA信号传导及ROS代谢调节,增强植物抵抗非生物逆境胁迫的能力,因此该基因在作物抗逆性改良上有潜在应用价值。为了获得转ABP9基因的玉米植株,向玉米抗逆育种提供新材料,构建了由组成型启动子Ub i驱动抗逆转录因子ABP9基因的植物表达载体,并通过农杆菌介导对玉米自交系齐319进行了遗传转化。经草铵膦抗性筛选和用两对不同的基因特异引物进行PCR扩增检测,证明已将ABP9基因导入玉米齐319基因组中,获得转基因植株。

玉米转录因子ABP9瞬时表达体系的建立

[目的]研究玉米抗逆相关转录因子ABP9在玉米抗逆应答中的功能及其表达调控机理。[方法]以2叶期玉米叶片为材料分离原生质体,通过PEG介导的转化方法,建立玉米叶肉原生质体瞬时表达ABP9的系统。利用该系统,通过反转录PCR和Western blot分别检测ABP9genomic∷FLAG融合基因在原生质体中的转录和翻译;并通过转化ABP9∷GFP融合表达载体和GFP荧光检测,对ABP9进行亚细胞定位。[结果]玉米原生质体瞬时表达ABP9系统中,ABP9genomic∷FLAG融合基因能够正确转录出mRNA并翻译出蛋白质;利用该系统进行亚细胞定位结果显示ABP9定位于细胞核中。[结论]玉米原生质体瞬时表达ABP9体系的建立,为进一步探究玉米中ABP9的表达和调控提供了良好的实验系统。

玉米转录因子ABP9基因的BAC克隆鉴定及染色体定位

为得到玉米转录因子ABP9的准确基因组序列及其旁侧基因组序列,应用PCR法对玉米自交系齐319 BAC文库中含有ABP9基因的单克隆进行筛选,得到了19个一级阳性混池,从中选择BAC-103、BAC-159进一步筛选获得了4个阳性单克隆。以其中1个阳性单克隆BAC-103-C3为模板进行全序列测定,比对分析后将ABP9基因初定位于玉米自交系Mo17基因组的3号染色体上。另以玉米自交系齐319、自交系Mo17萌发种子的根尖染色体滴片为材料,以绿色荧光标记的ABP9基因ORF区质粒DNA为探针进行荧光原位杂交,确认在这2个自交系中ABP9基因定位于3号染色体上。ABP9基因组序列的获得及其染色体定位为该基因分子标记的开发及应用于分子育种奠定了基础。

玉米转ABP9和ZmCBF3双基因植株的获得

[目的]获得转双基因的植株,研究植物逆境诱导基因ABP9和ZmCBF3的协同表达对玉米抗逆性的影响。[方法]通过农杆菌侵染的方法将ABP9和ZmCBF3基因同时转入玉米中,并对T0代植株进行分子鉴定。使用含有ABP9启动子驱动ABP9和ZmCBF3双基因载体的农杆菌侵染玉米幼穗,获得T0代种子;在田间通过对玉米苗喷洒草铵膦除草剂筛选获得具有草铵膦抗性的玉米植株。[结果]挑选10株抗性玉米苗小量提取DNA并进行PCR扩增分析,其中5个植株出现特异条带;大量提取PCR阳性玉米的DNA进行Southern杂交分析,9TQ-5号植株在与bar探针和ABP9探针杂交时均出现特异条带。[结论]9TQ-5号植株为转基因阳性植株,为后续试验提供了材料。

抗逆转ABP9基因马尼拉草和紫羊茅植株的鉴定

选取马尼拉草(Zoysia matrella)以及紫羊茅(Festuca rubra L.)'追寻者'品系作为相应的受体材料,采用实验室克隆的玉米(Zea mays)抗逆相关转录因子ABP9通过农杆菌介导和基因枪轰击2种方法进行遗传转化,获得再生植株;并对再生植株进行PCR、Southern和Northern杂交分子检测以及抗逆性鉴定。试验结果表明,成功获得ABP9在基因组中整合并表达,且抗逆性得到显著提高的转基因马尼拉草和紫羊茅植株。

玉米Cat1基因顺式元件ABRE2结合蛋白ABP9的基因克隆及功能分析

构建了授粉后17d（17dpp）的玉米幼胚cDNA基因文库,用玉米Catl基因顺式元件ABRE2通过酵母单杂交的方法筛选文库,获得3个完全相同的阳性克隆,命名为ABP9,用5’RACE的方法得到了该基因的全长cDNA序列。研究结果表明,ABP9属于bZIP类转录因子,与玉米Catl基因顺式元件ABRE2具有结合特异性,且在酵母细胞中具有转录激活功能。

转基因小麦抗旱性鉴定及相关指标灰色关联度分析

以9份转 ABP9基因春小麦株系UC4－1～UC4－9及其受体亲本宁春4号为材料，在雨养和灌溉条件下，对这些材料的主要农艺性状和部分生化指标进行了测定，采用隶属函数值法和抗旱性度量（D）值法对其抗旱性进行了综合评价，并利用灰色关联度法对相关抗旱性状与抗旱指数之间的关联度进行了分析评价。结果表明：6份转基因小麦的抗旱性较受体亲本宁春4号增强，3份材料的抗旱性较非转基因春小麦品种定西35增强；各农艺性状和生化指标与抗旱指数的关联度从高到低依次分别为株高、单穗粒重、穗长、SOD活性、穗粒数、结实小穗数、有效分蘖数、POD活性、千粒重、脯氨酸含量、MDA含量。