抗传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的研究 Ⅱ．AC─ELISA方法的建立

将所制备的腹水单抗ＡＢ７、ＢＧ９经硫酸铁盐析、透析，再经ＤＥＡＥ－纤维素柱层析纯化后，采用戊二醛二步法用辣根过氧化物酶标记单抗，建立了用于鉴别传染性法氏囊病病毒抗原型的ＡＣ－ＥＬＩＳＡ方法，并对国内的６个分离株及美国变异株１０８４Ａ进行了检测，结果表明，上述国内分离株均含有ＣＪ８０１株相一致的ＡＢ７、ＢＧ９位点，而１０８４Ａ株缺失ＡＢ７位点。

模拟抗原(Ac-NK16-Ahx-3)免疫反应抗体ELISA检测方法研究

为满足实验室单克隆抗体的制备研究,本实验特对实验室常用的制备单抗的模拟抗原(Ac-NK16-Ahx-3)进行ELISA间接法检测,进而建立一种高效的检测方法。通过对不同稀释度待测抗体的免疫吸附测定,检测出它的最终灵敏度为0.078mg/mL,最佳二抗稀释倍数为300倍,其最佳拟合曲线为y=-0.0732x+0.6875,R2=0.8619。并且,通过统计学方法进行统计分析,确定出各实验组的相关性及变异系数,从而排除实验中的操作误差,最终可确定最佳的实验条件,并保证实验的准确性。

T. pyogenes PLO蛋白单克隆抗体的制备与AC-ELISA方法的建立

为了建立可以定量检测化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)培养上清液中PLO蛋白含量的方法,试验首先制备针对毒力蛋白PLO分子第4结构域(D4)的单克隆抗体,然后应用筛选出的最佳捕获抗体,并结合辣根过氧化物酶(HRP)标记的靶向PLO分子第2结构域(D2)的单克隆抗体(HRP-AP-1A3)建立一种用于检测PLO蛋白含量的抗原捕获ELISA(AC-ELISA)方法,计算该方法的检测线,选择8种非T.pyogenes菌株验证该方法的特异性,绘制AC-ELISA方法的标准曲线,并应用该方法定量检测T.pyogenes HLJ-0912菌株培养上清液中wtPLO蛋白含量。结果表明:通过制备获得的5种单克隆抗体2G3、3G10、4C9、3C8、3C7对PLO蛋白均具有良好的特异性,其中单克隆抗体2G3、3G10、4C9、3C8是IgG2b亚型,均具有较强的抗溶血活性,靶向表位1(VEAGEATGLAWDPWWT);而单克隆抗体3C7是IgG1亚型,抗溶血活性非常弱,靶向表位2(KGTTLNPWVEDNVKS)。筛选出的最佳捕获抗体为单克隆抗体2G3,建立的AC-ELISA方法的最低检测限(OD_(450)值)为0.19。应用建立的AC-ELISA方法检测T.pyogenes HLJ-0912菌株的培养上清液为阳性,OD_(450)值为0.21;检测8种非T.pyogenes菌株的培养上清液均为阴性,OD_(450)值<0.19。标准曲线的方程为y=809.04x^(2)-85.695x,相关系数(R^(2))为0.999,拟合度较高。经AC-ELISA方法测定,在10,12,14小时时采集的T.pyogenes菌株培养上清液的OD_(450)值均高于最低检测限,培养上清液中的wtPLO蛋白含量分别为416.67,499.43,272.57 ng/mL。说明试验成功制备了针对PLO分子第4结构域的单克隆抗体,建立的AC-ELISA方法具有良好的特异性。

鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立及应用

为快速检测鸡传染性法氏囊病毒,使用纯化的鸡抗IBDV多克隆抗体和鼠抗IBDV单克隆抗体,建立了抗原捕获ELISA检测鸡传染性法氏囊病毒的方法。使用建立的方法可以检测到1∶160倍稀释的IBDV疫苗及阳性法氏囊组织中的病毒。检测禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎病毒及沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎球菌等结果均为阴性。检测IBDV超强毒和疫苗毒人工感染鸡的法氏囊、脾、肝及临床样品78份,检出阳性24份,与RT-PCR检测结果相符率为96%(75/78)。说明建立的方法敏感、特异,可用于法氏囊病的诊断和监测。

巨细胞病毒感染捕获ELISA分析方法的建立和应用

目的 :建立CMVIgM抗体捕获ELISA法并用聚合酶链反应 (PCR)技术对此方法进行了评价。方法 :采用巨细胞病毒 (CMV)AD— 16 9株感染人胚肺细胞的方法制备CMV抗原 ,并采用冻化抗原制备法及甘氨酸法制备抗原 ,羊抗人IgM (μ链 )McAb包被酶标板 ,建立CMVIgM抗体捕获ELISA法。结果 :不同浓度抗 μ链McAb包被 ,包被时间、包被液、封闭液等不同条件 ,以及抗原浓度、抗CMV抗体酶结合物浓度对此法的建立有不同的影响。PCR法与用最佳条件配盒后的本方法CMVIgM抗体检出率无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 :本法测定CMV—IgM抗体的敏感性和特异性较高 ,简便、适用 ,易于推广 。

mCry1Ac基因在抗虫转基因玉米Bt799中的表达特征

采用双抗夹心酶联免疫法(ELISA)定量检测转mCry1 Ac基因抗虫玉米Bt799在不同生育期不同植株部位的mCry1Ac蛋白含量。结果显示:mCry1 Ac基因在整个生育期玉米叶、茎、根和种子中均能表达,mCry1Ac蛋白含量为(0.82±0.10)^(15.83±1.77)μg·g-1;随着生育期和植株部位的不同,mCry1Ac蛋白含量呈现明显的时空动态变化,其中,叶、茎和根中mCry1Ac蛋白含量随转基因玉米生育期的推移均呈增加趋势,并均在完熟期达最高;在除苗期外的其他各生育期叶中mCry1Ac蛋白含量均显著高于其他植株部位,而在完熟期种子中mCry1Ac蛋白含量在各植株部位中最低,为(2.86±1.71)μg·g-1。

蓝舌病病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立

为建立蓝舌病病毒（BTV）病原学检测方法,本研究以纯化的BTV-1免疫绵羊和兔子,制备高免血清。以绵羊抗BTV血清为捕捉抗体、以兔抗BTV血清和羊抗兔Ig G-HRP为检测抗体建立了检测BTV的抗原捕获ELISA（AC-ELISA）方法。该方法能够特异性检测BTV,对羊痘病毒、赤羽病病毒无交叉反应,与鹿流行性出血热鸡胚样品有微量交叉反应,但样品OD450nm/阴性对照OD450nm低于阴阳性临界值,不影响结果判定;敏感性试验检测结果表明该方法可以检出102.79 TCID50的病毒;批内和批间重复性试验变异系数分别为1.44%~8.46%和2.26%~12.44%;采用该方法与RT-PCR方法对60份鸡胚样品进行检测,阳性符合率为90%。本研究建立的AC-ELISA方法为BTV抗原检测提供了一种快速、实用的技术手段。

IgM捕获ELISA应用于婴幼儿急性下呼吸道病毒感染早期诊断

利用抗人IgM μ链单克隆抗体和羊抗人IgMμ链抗体作为捕获抗体,建立了检测呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(AdV)和副流感病毒(PFV)抗体IgM的5层捕获ELISA方法。本法特异性好,较间接ELISA法敏感。用以检测RSV、PFV、AdV的抗体IgM与患儿血清IgG类抗体4倍增高的符合率较高。呼吸道分泌物抗原检测阳性者,血清RSV-IgM阴性率86.67％(13/15);PFV-IgM阳性率76.47％(13/17)。RSV、PFV、AdV感染发病后5天,IgM检出率均达70％以上。同时观察到RSV再次感染其IgM抗体有可能反应加强。本文认为5层捕获ELISA法对RSV、PFV和AdV急性下呼吸道感染是可靠的诊断方法之一。

基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定

【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为"捕获抗体",Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为"检测抗体",建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原,利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示,相对产出率随着筛选轮数的增加而提高,第4轮较第1轮提高了42倍;单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体,以试验孔OD450/阴性孔OD450大于2.1为阳性标准,从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落,经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆,分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。其中,hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现,在935 bp处均有明显的目的条带,通过对其进行测序和氨基酸序列比对,最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCry1Ac-A12在成功替换宿主菌HB2151后,经1 mmol·L-1 IPTG诱导表达,于30℃条件下培养过夜。其表达产物经His Trap HP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测,hsCry1Ac-A12蛋白分子量约为30 kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后,利用单链抗体为"捕获抗体",多抗为"检测抗体",建立了Cry1Ac双抗夹心ELISA检测方法。在1.25—2.43μg·mL-1线性检测范围内,线性回归方程为Y=0.2522X+1.2832(R2=0.9564),检测限为1.08 ng·mL-1。【结论】利用磁珠液相筛选方法,建立了针对Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,为快速、准确检测转基因食品中Cry1Ac提供了一种新的检测模式。

猪源粪肠球菌Ace蛋白间接ELISA方法的建立与应用

根据GenBank已发表粪肠球菌Ace基因(AF260879)的核苷酸序列设计1对引物,通过PCR扩增Ace基因保守序列A片段部分序列,将其克隆到pET-32a(+)裁体中,构建了原核表达载体pET-32a(+)-Ace,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,成功表达并纯化了重组蛋白;以此重组蛋白作为抗原建立了检测粪肠球菌Ace抗体的间接ELISA方法。经反复试验,确定该间接ELISA的最佳反应条件为:抗原包被浓度为1mg/L,被检血清稀释度为1∶800,1%BSA为封闭液,血清和二抗的作用时间均为60min,底物TMB反应时间为15min,反应的阳性判定值为0.126。交叉试验、批内重复和批间重复试验证明,所建立的间接ELISA方法具有特异性高、重复性好的特点,可用于粪肠球菌Ace蛋白血清抗体的检测。

鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的应用

通过中和试验证明 ,B34腹水单克隆抗体中和 IBDV CA株的中和效价高达 1∶42 0 0 0 0。经 1 0倍稀释后 ,能等量中和含毒量为 1 0 6.62 5TCID50 /ml的 IBDV CA株细胞毒。利用 B34腹水单克隆抗体建立了 MAb- AC- ELISA,可用于测定 IBDV CA株细胞毒的病毒含量 ,与 TCID50之间的相关系数为 0 .

糖原磷酸化酶同工酶BB测定方法的建立及其在急性冠脉综合征诊治中的价值

[目的]分离纯化糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB), 建立血清GPBB定量测定方法,探讨其在急性冠脉综合征早期诊断及治疗中的价值.[方法] 应用纯化GPBB抗原及其抗体建立GPBB定量测定方法.对34例健康人、28例不稳定心绞痛(UAP)患者和29例急性心肌梗死(AMI)患者分别进行血清GPBB、CK、CK-MB及cTnI测定.[结果] GPBB被纯化100倍,比活性384 μmol/mg*min-1,回收率28%.建立了GPBB定量测定方法,确定抗原检测线性范围为0.3～20 ng.在AMI发作6 h内,患者血清中(n=26)GPBB浓度超过正常上限值7.4 μg/L.GPBB诊断灵敏度是89.7%,明显高于CK、CK-MB(24.1%,20.8%,P<0.01),与cTnI相当.AMI患者血清GPBB峰值水平(66.38±27.41μg/L)明显高于健康人(2.57±1.61) μg/L,P<0.01.28例UAP患者中21例血清GPBB升高≥7.4 μg/L,其均值是(23.2±14.2) μg/L,明显高于健康人和稳定心绞痛患者血清GPBB水平(P< 0.01),与cTnI诊断阳性率相似,而UAP患者血清中CK、CK-MB均无明显升高.其中GPBB升高组 (≥7.4 μg/L)4周内发生心性事件远高于GPBB<7.4 μg/L组(47.6%,14.3%,P<0.01).AMI患者血清GPBB到达峰值时间早于CK和CKMB达到峰值时间.[结论]GPBB是AMI发作后6 h内敏感特异的生化指标,对判断UAP预后有一定的临床价值.

应用Mab-basedAC-ELISA法对鸡IBDV分离株的抗原特性分析

为了解传染性法氏囊病病毒(IBDV)的抗原变异分子基础,采用Mab-based AC-ELISA方法,利用11株单抗对2株河北IBDV分离株进行了抗原特性分析,并比较了超强毒株和弱毒株的VP2高变区序列的分子特征。结果显示:强弱毒株的抗原位点结合单抗的能力明显不同,除了Mab3、Mab9外,其余9个单抗的结合能力,超强毒株要高于弱毒株。超强毒株HeB-lf缺少了Mab3结合位点,弱毒株HeB-bdjz缺少了Mab3、Mab6结合位点,这说明强弱毒株不仅在序列上有差异,而且在抗原位点的缺失上也存在差异。本试验为控制IBD和疫苗改进具有重要意义。

重组人巨细胞病毒(HCMV)优势表位嵌合抗原的构建表达以及捕获法检测IgM抗体

通过计算机软件分析选择巨细胞病毒优势抗原表位,用聚合酶链式反应(PCR)扩增优势表位基因,构建了巨细胞病毒多优势表位嵌合抗原表达载体p4T-UL32-UL44-UL80a-UL83,转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,GST亲和层析法获得高纯度嵌合抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记嵌合抗原,并构建捕获法检测血清中的抗HCMVIgM抗体。结果表达的优势表位嵌合抗原具有很好的抗原性,用其建立的捕获法检测确诊的30份阳性和63份儿童阴性血,阳性检出率和阴性检出率都是100%说明用嵌合抗原构建的捕获法检测血清中抗HCMVIgM抗体具有更高的灵敏度和检出正确率,其检测水平已经达到国外的同类产品水平。

流行性出血病病毒抗原捕获ELISA方法的建立

为建立流行性出血病病毒(EHDV)病原学检测方法,本试验用纯化处理的4种血清型病毒(EHDV-2、5、6和8)混合免疫兔和豚鼠,制备高免血清。以兔抗EHDV为捕获抗体,豚鼠抗EHDV为检测抗体,羊抗豚鼠IgG-HRP为酶标抗体,建立了EHDV抗原捕获ELISA(antigen capture ELISA,AC-ELISA)方法。通过反应条件优化,获得最佳工作条件:5%马血清为稀释液,包被抗体1∶15 000稀释,检测抗体1∶20 000稀释,酶标抗体1∶15 000稀释。通过检测60份阴性样品确定临界值,P/N值≥2为阳性、P/N值<1.5为阴性;特异性试验表明该方法仅能检测出各血清型EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、赤羽病病毒(AKAV)及中山病毒(CHUV)无交叉反应;敏感性试验表明该方法可以检出102.47±0.07 TCID50的病毒;批内和批间变异系数均<10%;用RT-PCR与该方法同时对70份参考样品进行检测,符合率为92.86%。表明本试验建立的AC-ELISA方法为EHDV抗原检测提供了一种可靠实用的技术手段。

人巨细胞病毒UL32和UL44融合基因的表达及其抗原性分析

目的用聚合酶链式反应(PCR)扩增人巨细胞病毒UL32、UL44截短基因,构建pET-32a-UL32-UL44表达载体,转化宿菌大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,对目的蛋白进行纯化、标记HRP,用于检测IgM抗体。方法根据Gene-bank中HCMV的pp150、pp52蛋白序列,利用Protean计算机软件分析其亲疏水性和抗原性,选取适合的区段,根据其对应的UL32、UL44基因核苷酸序列设计合成引物,PCR扩增目的基因序列,经测序证明无误之后,克隆pET-32a-UL32-UL44重组质粒,将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,进行诱导表达,纯化目的蛋白,标记HRP,用ELISA捕获法对目的蛋白-HRP标记物的灵敏性和特异性等指标进行评价。结果成功构建pET-32a-UL32-UL44重组质粒,导入在BL21(DE3)菌株中,经诱导后目的蛋白表达于上清中,经纯化、标记HRP,标记物用于ELISA捕获法能够准确、特异地检测HCMV血清标本,80份血清检测结果显示其灵敏度可达92.5%,特异性达97.5%。结论 HCMV基因工程重组蛋白具有较好的免疫活性,为研制以基因工程重组抗原代替传统全病毒抗原的HCMV检测试剂盒打下了基础。