木薯花叶病毒AC4蛋白与AtPARN互作研究

木薯(Manihot esculenta Crantz)作为重要的热带作物,是全球六大粮食作物之一,并为全球近七亿人口提供主粮,然而病毒侵染引起的病害在全球范围内严重威胁木薯产业的发展。木薯花叶病毒病(cassava mosaic disease,CMD)是最有威胁的病害之一,造成严重的经济损失。斯里兰卡木薯花叶病毒(SriLankancassavamosaicvirus,SLCMV)是引发木薯花叶病的病原物之一,SLCMV是典型的双组分双生病毒,其基因组由DNA-A和DNA-B两个环状组分组成。无义介导的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD)是真核细胞mRNA降解的主要途径之一,也是真核生物普遍存在的抗病毒防御机制。越来越多的研究显示,NMD不仅是真核生物重要的mRNA数量、质量调控机制,还与转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)同样能降解病毒RNA,是真核生物普遍存在的抗病毒防御机制。NMD的mRNA衰减过程包括PTC的识别、脱腺苷酸、脱帽和最后的核酸外切酶降解4个过程,UPF1、PARN、DCP2和XRN4分别是上述4个过程中的关键蛋白。病毒是专性寄生生物,必须逃避或耐受寄主细胞的降解,才能成功感染。聚腺苷酸特异性核糖核酸酶[poly(A)-specific ribonuclease,PARN]是NMD信号通路的一个关键因子。目前,关于SLCMV抵御寄主NMD的分子机制尚不明确。本研究采用酵母双杂交(yeast two-hybrid system)和荧光双分子互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验证明斯里兰卡木薯花叶病毒(SLCMV)编码的沉默抑制子AC4与拟南芥PARN相互作用。据此推测SLCMV AC4蛋白可能通过与AtPARN相互作用而抑制寄主NMD的病毒防御功能帮助病毒逃避或耐受寄主细胞的降解。研究结果为阐明木薯花叶病毒调控寄主NMD抗病毒防御功能的分子机理奠定基础。

双生病毒AC4基因的克隆及原核表达

通过设计特异性引物,利用PCR技术克隆双生病毒AC4基因,并与原核表达载体pGEX-4T-1连接,导入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG成功诱导表达出分子量约36 KD的GST-AC4融合蛋白。对IPTG诱导浓度、诱导时间、诱导温度进行优化,获得最佳表达条件:IPTG诱导浓度0.50 mmol/L,诱导时间3 h,诱导温度32℃。研究结果对于下一步大量制备并分离纯化AC4蛋白、制备抗血清及研究SXYC-X4 AC4基因的功能具有指导意义。

Fus依赖ac4C修饰调控促进宫颈癌细胞增殖

目的:探讨Fus RNA结合蛋白(Fus)影响宫颈癌细胞增殖的机制。方法:通过MTT实验观察Fus对宫颈癌细胞HeLa增殖的影响;采用RT-qPCR和Western印迹观察人N-乙酰转移酶10(NAT10)对Fus表达的影响;利用RNA免疫沉淀实验(RIP)检测Fus mRNA的富集情况;通过RNA稳定性实验观察NAT10对Fus mRNA稳定性的影响;基于生物信息学软件PACES预测Fus mRNA上的ac4C修饰位点,构建含有Fus mRNA上ac4C修饰位点的野生型和突变型的EGFP报告质粒,利用EGFP-reporter实验和乙酰化RIP(ac4C-RIP)确定Fus mRNA上发生ac4C修饰位点;最后通过挽救实验观察NAT10介导Fus对宫颈癌细胞增殖的影响。结果:Fus促进宫颈癌HeLa细胞增殖(tFus=14.06,tsh R-Fus=5.74,均P<0.05);Fus蛋白和mRNA的表达水平随NAT10表达增加而增加(tNAT10=10.71,tsh R-NAT10-1=13.17,tsh R-NAT10-2=7.65,均P<0.05);RIP实验结果提示Fus mRNA与NAT10蛋白间存在相互作用(t=4.20,P<0.05),且NAT10过表达细胞中Fus mRNA具有较高ac4C修饰水平(t=30.62,P<0.05);另外,相对于载体对照细胞,NAT10过表达细胞中Fus mRNA的稳定性增高(P<0.01);发现Fus mRNA的925~939序列中的胞嘧啶为ac4C修饰位点;挽救实验结果显示NAT10介导Fus促进宫颈癌细胞的增殖(t=9.67、6.71,P<0.05)。结论:Fus mRNA被NAT10催化发生ac4C修饰,Fus表达水平被上调,继而促进宫颈癌细胞的增殖。

烟草曲茎病毒 AC4基因的原核表达与免疫定位

利用 PCR方法从烟草曲茎病毒 ( Tb CSV) Y3 5分离物的病株中获得 AC4基因 ,将其克隆到原核表达载体 p ET-3 0 a上获得重组质粒 p ET-Y3 5 AC4,重组质粒导入大肠杆菌 BL2 1 ( DE3 ) p Lys S中 ,IPTG诱导后 SDS-PAGE发现 ,AC4蛋白已在大肠杆菌中获得了表达。利用 Ni2 +-NTA亲和树脂纯化了 AC4重组蛋白 ,免疫家兔获得 AC4蛋白的多克隆抗体。利用免疫胶体金技术对感病烟草中AC4蛋白进行定位发现,TbCSV AC4蛋白主要在细胞质的叶绿体和线粒体中积累。

抗球虫新药AC4在SD大鼠体内的药代动力学研究

本研究的目的是建立检测SD大鼠血浆内AC4的分析方法,考察高、中、低3个剂量的AC4在SD大鼠体内的药代动力学特征,获得主要的药代动力学参数。采用超高液相色谱法检测SD大鼠血浆内AC4含量,使用乙酸乙酯作为提取溶剂,妥曲珠利亚砜作为内标。研究表明,建立的方法专属性良好,标准曲线定量范围0.08-80μg/mL,线性关系良好;准确度和精密度均能达到检测目的,样品在室温放置8 h或者反复冻融3次后稳定;该方法灵敏、准确,可以用于检测SD大鼠血浆内AC4含量。药时曲线下面积和最大血药浓度存在剂量正相关关系,给药后4-5 h达到最大血药浓度,生物消除半衰期在不同性别、不同剂量组之间存在较大差异,AC4在SD大鼠的药动学存在较为明显的性别差异。本研究结果为AC4后期研究和临床合理应用提供了参考依据。

中国番茄黄化曲叶病毒编码的RNA沉默抑制子AC4蛋白的核酸结合特性

农杆菌共浸润试验结果表明:中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)Y10分离物编码AC4蛋白是RNA沉默抑制子。为了研究RNA沉默抑制子AC4蛋白的作用机制,将TYLCCNV-Y10的AC4基因插入到原核表达载体pET-32a的多克隆位点上,构建重组原核表达载体pET32a-Y10AC4。将重组载体导入BL21(DE3)pLysS进行AC4蛋白表达,并在自然条件下纯化蛋白。利用原核表达的AC4蛋白进行电泳迁移率变动试验(electrophoretic mobilityshift assay,EMSA),分析AC4蛋白分别与单、双链siRNA和单、双链长RNA的结合情况。试验结果表明:TYLCCNV-Y10编码的AC4蛋白具有结合单链siRNA和单链长RNA特性,而不与双链siRNA和双链长RNA结合。

AC4CH铝合金的挤压铸造研究

采用挤压铸造生产AC4CH合金铸件,研究了铸造压力、充型速度和充型距离对挤压铸件组织和性能的影响。挤压铸造AC4CH铝合金铸件组织由初生α-Al和共晶硅相组成,随着充型距离的增加,铸件显微组织明显细化。随着铸造压力和充型速度的增大,共晶相含量降低并且分布均匀。铸造压力和充型速度的增大可提高铸件的抗拉强度、屈服强度,但是铸造压力增大到一定程度后强度上升幅度减缓。

高效液相色谱法测定AC4可溶性粉中AC4的含量

研究旨在建立一种测定可溶性粉剂中AC4含量的高效液相色谱方法.采用C18色谱柱,流动相为甲醇和0.2％磷酸水溶液（v/v,65：35）,流速为1 mL/min,柱温为30℃,紫外检测波长为251 nm.该方法专属性好,具有良好的线性关系,线性范围为0.07～0.13 mg/mL,R2=0.9987,AC4的平均添加回收率为98.45％,相对标准偏差为0.5044％,24h内稳定性良好.该方法操作简单,精密度及重现性生好,可用于可溶性粉剂中AC4的含量测定.

苏云金芽胞杆菌cry2Ac4基因在大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)cry2Ac4基因;笔者以含有BtWB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。

高效液相色谱法(HPLC)测定饲料中AC4的含量

研究旨在建立一种检测饲料中AC4含量的高效液相色谱方法。饲料经乙酸乙酯提取，正己烷液液萃取净化，以甲醇-0．2％磷酸水溶液（体积比65：35）为流动相，在C18色谱柱上，紫外检测器（波长251nm）下分离检测。该方法有很好的线性关系，在添加浓度范围内，AC4的平均回收率为98．4％-106．4％，日内变异系数为0．7％～4．6％，日间变异系数为3．6％～4．3%经验证该方法操作简单，灵敏度高，准确性和重现性良好，可用于测定饲料中AC4含量的测定。

热处理工艺参数对AC4CH(ZL101H)合金组织和性能的影响

探讨了固溶温度、固溶时间、时效温度及时效时间对AC4CH(ZL101H)合金组织和性能的影响,获得了对生产具有指导意义的工艺参数。

AC4原料药含量的HPLC测定方法研究

为建立测定AC4原料药含量的高效液相色谱（HPLC）测定方法,色谱柱：Diamosil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）,流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液,65∶35（v/v）,流速为1.0 m L/min,检测波长251 nm。结果显示,AC4浓度在20~200μg/m L范围与峰面积呈现良好的线性关系,回归方程A=43743ρ＋26 016,R2=0.9999（n=5）,平均回收率100.3%,RSD为0.54%,样品至少在8 h内稳定。表明该法快速简捷、准确度高,适用于AC4原料药含量测定。

AC4D铸铝合金气缸盖渗漏故障成因分析

利用扫描电镜和光学显微镜等手段,对发生渗漏的缸盖,进行测试和定量分析,找到了渗漏问题形成的原因,并提出了消除渗漏故障的措施。生产现场实施表明,改进措施有效改善了铸件的冶金质量,缸盖铸件的水油隔层的缺陷明显减少,发生腔内渗漏的几率大幅度下降。

乙酰转移酶10通过介导盘状蛋白结构域受体1 mRNA的ac4C乙酰化修饰促进宫颈癌细胞的恶性行为

乙酰转移酶10(N-acetyltransferase 10,NAT10)是mRNA乙酰化修饰的关键酶,通过介导ac4C乙酰化修饰(N4-acetylcytidine,ac4C)调控靶基因的表达并调控多种癌症的生物学功能,但NAT10对宫颈癌(cervical cancer,CC)细胞的调控却少有报道。本研究拟探讨NAT10对宫颈癌细胞恶性行为的影响。首先,通过数据库分析发现NAT10高表达与宫颈癌病人预后不良相关。MTT实验和集落形成结果显示,过表达NAT10增加了宫颈癌细胞的生长活性(P<0.05)和增殖能力(P<0.001);Transwell迁移和侵袭结果表明,过表达NAT10提高了宫颈癌细胞的迁移(P<0.01)和侵袭(P<0.05)能力;Western免疫印迹结果显示,过表达NAT10使间皮细胞标志物波形蛋白(vimentin)上调,使上皮细胞标志物E-钙黏着蛋白(E-cadherin)下降。并且,生物信息学分析显示,盘状蛋白结构域受体1(discoidin domain receptor 1,DDR1)可能是NAT10的下游靶基因,RNA结合蛋白免疫沉淀结果表明,NAT10可以直接结合DDR1的mRNA(P<0.05),Western免疫印迹和RT-qPCR的结果表明,过表达NAT10使DDR1蛋白质水平和mRNA水平明显上调(P<0.05)。此外,RNA乙酰化免疫沉淀结果表明,过表达NAT10增加了DDR1 mRNA的乙酰化水平(P<0.001),并且EGFP报告系统进一步确定了NAT10识别DDR1 mRNA的乙酰化位点。mRNA半衰期的结果显示,NAT10可提高DDR1 mRNA的稳定性(P<0.05)。综上所述,NAT10促进宫颈癌细胞的生长、增殖活性以及迁移侵袭能力,其机制是通过对DDR1 mRNA进行乙酰化修饰延长其mRNA的稳定性,这可能为mRNA乙酰化修饰对宫颈癌发生发展的分子机制提供新的见解。

Microstructures and mechanical properties of MgAl_2O_4 particle-reinforced AC4C aluminum composites

MgAl2O4 particle-reinforced AC4C based alloy composites were fabricated by the stirring-casting method. The effects of the average sizes and the size distributions of MgAl2O4 particles on the dispersibility were investigated, and the microstructures, strength, and fatigue properties of MgAl2O4 particle-reinforced AC4C based alloy composites were evaluated. Tensile strength in the MgAl2O4 particle-reinforced AC4C based alloy composite was increased by using the classified particles. The fatigue limit at 107 cycles in the MgA1204 particle-reinforced AC4C-Cu composite increased by 27% compared to the unreinforced alloy at 250 ~C. Dislocations were observed in the matrix around the MgAl204 particle which resulted from the mismatch of thermal expansion coefficients between MgAl2O4 and Al, and resisted failure and caused fatigue cracks to propagate around the MgAl2O4 particles, resulting in extensive crack deflection and crack bowing which contributed to the improvement of fatigue strength.

浅析AC4型转向架主要生产工艺

转向架是轨道交通车辆的重要组成部分之一,它承载着整个车辆的重量。转向架的产品质量直接影响着车辆运行的安全性和可靠性。本文是浅析美国GE公司AC4型转向架的主要生产工艺,包括转向架构架、制动支架及衬套等零部件的机械加工、装配及热处理工艺。

东莞富佳电子陶瓷电容额定电压为AC4kV

富佳电子有限公司(Dongguan Richwell Electronics Co.,Ltd)最新JN11E152系列陶瓷电容的容值为1．5nF±20％。此系列器件额定电压为AC4kV，适用于电源及监视器。另外，JN11E152系列陶瓷电容有低内阻特点，并采用卷带包装供货。

AC4B合金低压铸造生产4G1发动机缸盖

低压铸造应用非常广泛,调整浇注压力与铝液速率,细化成分要求改善高现场铸造条件的稳定性和兼容性,对提高4G1发动机缸盖的铸造质量具有重要作用。

中国番茄黄化曲叶病毒和烟草曲茎病毒AC2和AC4蛋白为RNA沉默的抑制子

中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物(TYLCCNV-Y10)能系统侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana) 等寄主植物,但不诱导明显的症状,而烟草曲茎病毒Y35分离物(TbCSV-Y35)单独侵染则诱导曲叶等症状.对表达GFP基因的转基因本氏烟接种实验表明,TYLCCNV-Y10不回复已建立的GFP沉默,也不抑制GFP沉默的建立;而TbCSV-Y35能部分回复已建立的沉默,且能在新叶抑制沉默的建立.农杆菌共浸润实验结果表明,TYLCCNV-Y10和TbCSV-Y35的AC2和AC4蛋白都能抑制GFP的局部沉默,并延迟GFP的系统沉默,为RNA沉默的抑制子.比较共浸润区GFP mRNA的积累结果表明,Y10 AC2与Y 35AC2蛋白具有相近的RNA沉默抑制能力,而Y35 AC4蛋白是一个比Y10 AC4蛋白更强的抑制子.因而,TbCSV-Y35和TYLCCNV-Y10致病性差异的原因可能与二者AC4蛋白的功能差异有关.