腺伴随病毒介导ADNF-9基因转染对豚鼠卡那霉素致聋的治疗作用

目的:观察包装重组的腺伴随病毒(adeno-associated virus,AAV)r AAV-NT4-ADNF-9对卡拉霉素致聋豚鼠的治疗作用。方法:选用耳廓反射和听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)正常的白色红目豚鼠,在大腿内侧肌肉注射卡那霉素400 mg/(kg·d),连续注射6 d,制备耳聋模型。在全身麻醉的条件下,从豚鼠右耳背侧进路,打开听泡,用微量注射器由圆窗注入r AAV-NT4-ADNF-9 10μL,14 d后取术侧听泡。进行耳蜗毛细胞计数和耳蜗毛细胞的硬铺片,通过相差显微镜观察内耳毛细胞的结构。结果:r AAV-NT4-ADNF-9组治疗后ABR阈值较治疗前明显下降(P<0.05),相差显微镜观察到耳蜗基膜完整,外毛细胞呈点状缺失。而其余3组治疗前后ABR阈值无明显变化,人工淋巴液组与空载体组治疗后毛细胞呈片状缺失,空白对照组则无毛细胞缺失。ADNF组取景框内毛细胞平均数明显高于人工淋巴液对照组及空载体组(P<0.05)。结论:用r AAV-NT4-ADNF-9转染卡那霉素致聋豚鼠耳蜗组织,可促进耳蜗毛细胞修复和再生。

重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9的构建及其对体外培养的大鼠耳蜗组织的转染

目的:包装携载神经营养素(NT4)与活性依赖性神经营养因子-9(ADNF-9)融合基因的重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9,并观察该重组病毒对体外培养的耳蜗组织的转染。方法:使用pSSHG-CMV-NT4-ADNF-9,pGF140和pAAV/Ad 3种质粒共转染293包装细胞,制备ADNF-9重组腺相关病毒(recomb inate adeno-assoc iated virus,rAAV),应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度;体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞;将重组病毒感染体外培养的新生SD大鼠耳蜗毛细胞,于24 h后提取组织行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以检测rAAV-NT4-ADNF-9对耳蜗的转染。结果:应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度为2×1013cfu/m l,表明成功地构建了重组AAV载体。成功分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞后,经RT-PCR反应,琼脂糖凝胶电泳检测结果显示NT4-ADNF-9在耳蜗组织得到了表达。结论:构建的重组病毒rAAV-NT4-ADNF-9,在体外可成功转染耳蜗组织,用于基因治疗的研究。

腺伴随病毒介导的NT4-ADNF-9对Corti器损伤保护的体外研究

目的将携载神经营养素(NT4)与活性依赖性神经营养因子-9(activity-dependent neurotrophicfactor-9,ADNF-9)融合基因的重组腺伴随病毒rAAV-NT4-ADNF-9转染体外培养的耳蜗Corti器,并观察该重组病毒对Corti器损伤的保护作用。方法体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗基底膜,应用氨基糖苷类毒性蛋白G-418建立体外Corti器损伤模型,将rAAV-NT4-ADNF-9转染体外培养的新生SD大鼠耳蜗细胞(Corti器),RT-PCR检测NT4-ADNF-9在Corti器的表达,并观察其对体外毛细胞的保护作用。结果成功分离培养了新生SD大鼠的耳蜗基底膜后,经重组腺伴随病毒转染,琼脂糖凝胶电泳检测结果显示NT4-ADNF-9在Corti器得到了表达;rAAV-NT4-ADNF-9保护组毛细胞损伤程度较G-418损伤组明显为轻,而G-418损伤组可见毛细胞大量缺失,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论构建的重组病毒rAAV-NT4-ADNF-9在体外可成功转染Corti器,并对Corti器具有保护作用,可用于基因治疗的研究。

重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9转染大鼠耳蜗组织的体外研究

目的:包装携载神经营养素(NT4)与活性依赖性神经营养因子-9(ADNF-9)融合基因的重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9,并观察该重组病毒对体外培养的耳蜗组织的转染。方法:使用pSSHG-CMV-NT4-ADNF-9、pFG140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备ADNF-9重组腺相关病毒(AAV),应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度;体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞;将重组病毒感染体外培养的新生SD大鼠耳蜗毛细胞,于24h后提取组织行RT-PCR以检测rAAV-NT4-ADNF-9对耳蜗的转染。结果:应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度为2×1016cfu/L,表明成功构建了重组AAV载体。成功分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞后,经RT-PCR反应,琼脂糖凝胶电泳检测结果显示NT4-ADNF-9在耳蜗组织中得到表达。结论:构建的重组病毒rAAV-NT4-ADNF-9在体外可成功转染耳蜗组织,用于基因治疗的研究。