亚洲百合及东方百合AGPase酶活性及表达量与淀粉含量的相关性

【目的】探明两类百合不同发育时期的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)活性、AGPase基因表达量与淀粉含量的相关性。【方法】使用qPCR、连续监测法、蒽酮法分别测定材料AGPase基因的表达量、酶活性及淀粉含量,再对比两类百合的异同,以得到两类百合AGPase基因的表达量、酶活性与淀粉含量各自的特点及各因素间的相关性。【结果】所有克隆到的AGPase基因都具有PLN02241家族蛋白结构特征;定量结果表明,两类百合AGPase大亚基基因表达模式相同,总体趋势类似。小亚基基因表达模式存在差异,且小亚基基因的表达量低于大亚基基因;淀粉及酶活性测定结果表明,两类百合总体趋势一致。相关性分析表明,AGPase小亚基基因的表达量、AGPase酶活性与淀粉含量在鳞片中高度线性相关,且叶片中的酶活性与鳞片中的淀粉含量也高度线性正相关。【结论】两类百合不同时期的淀粉含量及酶活性变化趋势相同,但同一发育时期不同类型百合的淀粉含量及酶活性存在差异。两类百合大小亚基基因的表达量在鳞茎不同时期的表达模式相似,但同一发育时期不同类型百合的基因表达量存在差异。AGPase小亚基基因的表达量与淀粉含量正相关。

导入AGPase基因的转基因可育水稻及其经济性状的研究

以农杆菌介导法将淀粉合成关键酶AGPase (腺嘌呤二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 )基因导入云南地方优质水稻合系 35 ,38,39,4 1,4 2中 ,获得了大量的可育转基因植株。PCR扩增检测 ,外源基因已稳定整合进水稻基因组中。大量的农艺性状及淀粉含量研究表明 ,转基因水稻种子的千粒重比对照明显提高 。

小麦AGPase胞质型大亚基基因的克隆与表达分析

从大粒型小麦品种豫教2号中克隆出调控小麦ADPG焦磷酸化酶(AGPase)胞质型大亚基基因(LSUI)cDNA全长。在花后15d的小麦植株中,通过半定量PCR法,发现LSUI基因在叶、籽粒、叶鞘和颖壳中表达量较高,但在根和茎中表达量较低,表明在绿色光合功能器官和淀粉合成器官中,LSUI基因量表达较高。比较了LSUI基因在千粒重不同的豫教2号和兰考矮早八两小麦品种籽粒发育过程中的表达差异后,发现在籽粒形成期,LSUI基因在两品种籽粒内表达相似,但在籽粒灌浆期和成熟期间,LSUI基因在千粒重较高的豫教2号内表达量明显高于千粒重较低的兰考矮早八,这个表达差异与两品种间淀粉积累差异趋势相似,表明LSUI基因的表达量可能与淀粉的积累量密切相关。

AGPase基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

将大肠杆菌BL21的AGPase基因定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,从而构建植物表达载体,转化烟草获得了转基因植株。经GUS组织化学染色、PCR、Southern blot以及RT-PCR鉴定证实,该基因已导入烟草基因组中。淀粉含量测定结果显示,转基因植株比非转基因植株淀粉含量平均增加了13.1%,由此验证了该载体构建的成功与可用性,为下一阶段用该载体转化木薯主栽品种提高块根淀粉含量的研究奠定了基础。

小麦AGPase4个亚基的克隆及其组织特异性表达

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶—AGPase的胞质型小亚基(cytosolic small subunit,SSUⅠ)、质体型小亚基(plastidial small subunit,SSUⅡ)、胞质型大亚基(cy-tosolic large subunit,LSUⅠ)和质体型大亚基(plastidial large subunit,LSUⅡ)的cDNA序列。所克隆的基因cDNA序列长度分别为1 4651、6311、941和535 bp。序列比对结果显示SSUⅠ、LSUⅠ和LSUⅡ与已往报道的大麦、小麦、玉米、水稻等相关基因的同源性较高,而SSUⅡ的cDNA序列为首次克隆,与大麦SSUⅡ相比,5'端缺失编码转移肽的一段序列,表明其可能对质体AGPase活性产生一定影响。通过半定量PCR法发现SSUⅠ与LSUⅠ在籽粒中表达量较高,而SSUⅡ和LSUⅡ在叶片中丰富表达。

小麦AGPase胞质型基因LSUI的克隆及正义、反义与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出AGPase胞质型大亚基基因(large subunit,LSU I)的cDNA全长(1947 bp,GenBank No.DQ839506),同源性比较结果表明,与GenBank上已报道的LSU I基因同源性达99%,虽与其有2处碱基不同(与Z21969相比,分别在851 bp处的T变为C和926 bp处的G变为A),但他们的氨基酸序列相同,故不影响其功能.以pBI121质粒为基础,通过中间载体pBSK,构建了由35S启动子调控的LSU I基因的正义表达载体pBI121LSUⅠS;将该基因反向置于pBI121质粒的CaMV35S启动子之后,构建了LSU I的反义表达载体pBI121LSUⅠA.同时还克隆出LSU I基因的250 bp片段,以pFGC5941质粒为基础,构建了RNAi干扰载体pFGCLsuⅠ,这为研究该基因的功能打下了很好的基础.

木薯AGPase酶活性及其同工酶位点检测

本文以3个亲缘关系较远的高产木薯品种(SC124,SC8和Arg7)为材料,对块根发育过程中的AGPase活性和淀粉含量进行了测定,并利用AGPase同工酶电泳技术(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)对AGPase酶活性较高时期同工酶位点进行检测,旨在分析木薯块根AGPase同工酶位点与AGPase酶活性和淀粉积累的关系。结果表明:木薯块根发育过程中AGPase酶活性和淀粉含量呈极显著正相关(R=0.80212),Arg7的AGPase酶活性和淀粉含量在块根发育都显著高于SC124和SC8。同工酶分析表明,木薯至少有6个同工酶位点(AGPa,AGPb,AGPc,AGPd,AGPe和AGPf),且品种间具有多态性。其中,3个品种共有的4个同工酶位点分别为AGPa、AGPc、AGPd和AGPf,AGPe位点只在Arg7中出现,初步判断同工酶位点AGPe可能与其较高的酶活性和淀粉含量有关。本研究为系统研究木薯品种间AGPase酶活性与淀粉积累的关系提供了参考。

AGPase基因转化木薯获得转基因植株的研究

通过农杆菌介导法将一个提高淀粉含量的AGPase基因在块根特异启动子的调控下成功导入木薯华南8号(SC8)基因组,并获得转化抗性再生植株25株,转化率为1.20%。经生根初筛有19株转化植株能在抗性生根培养基生根,经PCR、Southern等分子检测证实这19株转化植株为转基因植株。

苦荞AGPase编码基因FtAGPL和FtAGPS全基因组鉴定和表达分析

AGPase是植物淀粉合成的第一个限速酶,直接决定淀粉的合成速率和积累量,是由2个大亚基(AGPL)和2个小亚基(AGPS)构成的异源四聚体。研究从苦荞全基因组水平鉴定到4个AGPL编码基因(命名为FtAGPL1~4)和2个AGPS编码基因(命名为FtAGPS1~2)。这6个基因编码蛋白质的长度在515~532个氨基酸之间,分子量在56.6~59.4 kDa之间,均为亲水蛋白,定位于细胞质和线粒体中。基因结构分析表明,4个FtAGPL和2个FtAGPS基因具有较多的外显子(9~14个)。氨基酸多重序列比对表明,6个蛋白均含有葡糖磷酸腺苷酰基转移酶保守结构域(PLN02241)。进化关系分析表明,苦荞FtAGPL和FtAGPS与双子叶植物拟南芥AtAGPL和AtAGPS蛋白的亲缘关系更近。表达分析表明,4个苦荞AGPL和2个AGPS基因在苦荞不同发育时期的种子中均有表达,其中FtAGPL2、FtAGPL4和FtAGPS1在种子中优势表达。以上研究结果为从分子水平上解析苦荞种子淀粉合成调控机制提供了重要线索。

小麦籽粒内AGPase质体型小亚基的克隆和序列分析

文章从小麦籽粒中克隆了淀粉合成关键酶AGPase的质体型小亚基(SSU Ⅱ)的cDNA序列。其中间部分与3'端序列与大麦SSU Ⅱ(Z48563)的同源性高达97%,但在5'端特异的转移肽切割位点却比Z48563缺失一段113bp序列。本文克隆的SSU Ⅱ其特异5'端序列与已报道的大麦(Z48563)、小麦(536819)、玉米(AF334960)进行多序列比对和同源性比较显示,它们的亲缘关系较远,表明这可能是一个新的SSU Ⅱ基因。另外,在检测的22个现今推广面积较大的小麦品种中,SSU Ⅱ 5'端缺失序列的现象都普遍存在。

小麦AGPase胞质型小亚基SSUI的克隆及过表达反义表达与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶AGPase胞质型小亚基(AGPase plastic small subunit,SSU I)的cDNA全长,并构建了此基因的过表达、反义表达和RNAi干扰载体.SSUI的cDNA全长为1465 bp(GenBank No.EF405961),编码域长度为1 422 bp,位于EF405961的2～1 423 bp.同源性比较结果表明:与GenBank上已报道的SSU I基因(X66080,AF244 997,Z48562)同源性达98%～99%.以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的SSU I基因的过表达载体pWM101SSU I S;将该基因反向置于pBI121质粒的CaMV35S启动子之后,构建了SSU I的反义表达载体pBI121SSU I A.同时还克隆出SSU I基因的一段260 bp高保守序列,以pFGC5941质粒为基础,构建了RNAi干扰载体pFGC5941SSU I.

玉米AGPase胞质型小亚基ZmSSUI基因的克隆及在籽粒发育过程中的表达

利用RT-PCR方法从普通玉米浚单20中克隆出淀粉合成关键酶-腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-Glucose Pyrophosphorylase,AGPase）胞质型小亚基（cytosolic small subunit,SSUI）基因的cDNA序列,命名为ZmSSUI（GenBank登录号：GU550073）。序列分析表明,该cDNA序列长度1554 bp,包含一个完整的开放阅读框（2~1 429 bp）,长度为1 428 bp,编码476个氨基酸,克隆基因编码的氨基酸序列与其他植物SSUI氨基酸序列有较高同源性。半定量RT-PCR分析表明,在籽粒发育过程中,ZmSSUI基因的表达呈单峰状变化,与已报道的AGPase酶活性及淀粉积累速率趋势基本一致,推测其在玉米淀粉合成中发挥着重要作用。

AGPase基因植物过表达载体的构建及对甘蓝型油菜的转化

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉合成途径的关键酶。本研究克隆了大肠杆菌AGPase基因glg C,并通过双定点突变降低其对无机磷酸盐敏感性所致抑制作用以提高其酶活。而后将甘蓝型油菜AGPase导肽编码序列与glgc融合,构建成植物表达载体p MB-TG,并导入根癌农杆菌LB4404。利用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,获得转基因植株。PCR及半定量RT-PCR检测结果显示,该融合基因已导入油菜再生植株基因组并获得表达。增加淀粉积累为油脂合成提供更多碳源,被认为是一条潜在的提高油菜种子含油量的有效途径。本研究为利用遗传改良技术实现上述途径在油菜育种中的应用奠定前期基础。

玉米AGPase基因启动子的克隆及鉴定

以玉米基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增得到了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶AGPase基因编码区上游1 912 bp的启动子(AGPasep)序列。该序列包含TATA-box,CAAT-box等一些高等植物特有的启动子基本核心序列,推断其为一种新的启动子。为了验证该序列是否具有启动子功能,构建了含有此序列的植物表达载体pCAM-AGPasep,通过农杆菌介导法转化玉米愈伤组织进行瞬时表达。GUS染色结果表明,该序列可以驱动GUS基因的表达,具有启动子功能。

荧光发光测定AGPase活力方法初步建立及应用

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)活力传统上采用32P同位素标记反应底物来测定,但因测定条件的限制而极大地影响了其应用。该研究依据荧光素酶催化荧光素生成发光氧化荧光素的原理,在优化基本反应体系、确立反应体系ATP浓度和荧光强度线性关系等基础上,初步建立了以荧光发光反应测定AGPase活力的新方法,并运用新方法测定了含有不同glgC基因拷贝数菌株的AGPase活力。测定结果显示,不同菌株AGPase活力随glgC拷贝数不同存在显著差异,且其变化趋势与理论预期一致,即新方法可用于AGPase活力的体外测定,且具有更加安全、灵敏、简便和成本低的特点。

木薯AGPase基因家族的生物信息学及其表达分析

【目的】搜索鉴定木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的基因家族成员,并分析其生物学信息及不同组织和非生物胁迫下的表达情况,为木薯AGPase基因的功能挖掘及淀粉性状遗传改良提供理论依据。【方法】从木薯基因组数据库(Phytozome)下载木薯全基因组序列,从中筛选含NTP_transferase(Pfam编号PF00483)保守结构域序列的AGPase基因家族成员,利用生物信息学方法对其结构特征及编码蛋白序列进行分析。基于NCBI转录组测序(RNA-seq)数据,对木薯AGPase基因家族成员在不同组织及冷害和干旱胁迫下的表达模式进行分析。【结果】从木薯全基因组序列中共鉴定出9个AGPase基因家族成员,包含6个AGPase大亚基(LS)基因和3个小亚基(SS)基因。6个LS基因在长度和编码氨基酸数目上差异明显,但3个SS基因间的差异不明显。LS基因外显子数目为8～15个,SS基因外显子数目均为9个。9个木薯AGPase基因家族成员分布于8条染色体和1个scalefold中,未在染色体上发现串联成簇分布现象。木薯AGPase基因家族启动子区域含有多个干旱响应元件、光响应元件、激素响应元件及多种除干旱外的其他非生物胁迫响应元件。9个AGPase基因家族成员在不同木薯组织间的表达模式具有组织特异性。经冷害胁迫后,除MeAGL1.3基因外,其余8个基因表达量均极显著(P<0.01,下同)或显著(P<0.05,下同)下调;经干旱胁迫后,MeAGL1.4、MeAGS1.1、MeAGS1.2和MeAGS2基因表达量极显著或显著下调,MeAGL1.3基因的表达量显著上调,其余基因与对照无显著差异(P>0.05)。【结论】木薯AGPase基因家族成员具有保守的基因结构和功能结构域,其表达具有组织特异性,大多数成员表达水平受冷害和干旱胁迫调控。

小麦AGPase基因LSU Ⅱ的克隆及反义表达与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶—AGPase质体型大亚基(AGPase plastidial large subunit,LSU Ⅱ)cDNA一段特异保守序列,长度为535 bp(GenBank No.EF378944),与DQ409820(小麦)、U66876(大麦)、AK069296(水稻)和DQ406819(玉米)分别有98%,97%,88%,88%的同源性,表明克隆出了小麦LSU Ⅱ基因的部分cDNA序列。以pWM101质粒表达载体为基础,将LSU Ⅱ反向置于pWM101质粒的CaMV35S启动子之后,构建了LSU Ⅱ的反义表达载体pWM101LSUIIA;另外,用pFGC5941干扰载体构建了LSU Ⅱ基因的RNAi载体pFGC5941 LSU ⅡSA,这些载体的构建为研究LSU Ⅱ基因的功能打下了基础。

木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因全长克隆

【目的】克隆木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)小亚基基因cDNA全长序列,为木薯高淀粉品种的分子育种提供依据。【方法】根据木薯AGPase小亚基基因已知片段设计特异性引物,以木薯根、茎、叶为材料,利用PCR及RACE克隆木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列。运用生物信息学方法对其核苷酸序列和推导氨基酸的理化性质、蛋白质三级结构进行系统分析。【结果】克隆获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基cDNA全长1566bp,其中包括1566bp的完整ORF,编码一个含521个氨基酸的多肽。其理论蛋白质分子量57.01kDa,等电点6.1,呈酸性。多重序列比较分析结果显示,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基核苷酸序列与蓖麻、麻风树和杨树相应序列的相似性分别为87%、87%和86%。结合系统进化树分析结果推测,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基在不同物种及进化过程中具有高度的保守性。蛋白三级结构分析结果表明,木薯AGPase小亚基蛋白具有15个α-螺旋、24个β-折叠和多个转角。【结论】木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列与蓖麻、麻风树和杨树等具有较高的同源性。

AGPase及其基因表达研究

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉生物合成的限速酶,本文讨论了到目前为止对不同植物AGPase基因及其表达的研究结果。其中包括AG-Pase大小亚基编码基因表达的分布及调控。其结论为:完整AGPase两个大亚基和两个小亚基对合成正常含量的淀粉缺一不可;有多个等位基因编码植物AGPase大小亚基,它们表现发育阶段、组织器官、细胞质体内外及诱导条件的分化表达;尽管各亚基表达于含淀粉的组织,但它们在储藏组织内的表达量远高于其他组织;对调控不敏感的外源AGPase基因导入淀粉植物将会成为提高淀粉含量的重要途径。提出了进一步研究中存在的问题及可能的解决途径。

陆地棉AGPase基因家族的鉴定及表达分析

【目的】腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(adenosine diphosphate-glucose pyrophosphorylase,AGPase)是淀粉生物合成途径的限速酶,在植物“源”、“库”器官淀粉的合成与积累过程中扮演着重要角色,然而棉花中AGPase基因家族的系统研究工作尚未开展。【方法】基于已公布的陆地棉标准系TM-1基因组数据,利用生物信息学方法对陆地棉AGPase基因家族进行全基因组鉴定,并对该家族成员的理化性质、系统进化关系、基因结构、启动子区顺式作用元件进行分析。利用转录组数据和实时荧光定量聚合酶链式反应分析AGPase家族基因的组织表达特性和在非生物胁迫下的表达模式。【结果】在陆地棉基因组中,共鉴定到20个AGPase基因(GhAGP),不均匀地分布在16条染色体上。GhAGP基因包含12个大亚基基因和8个小亚基基因共2类,同一类GhAGP基因具有相似的保守基序和外显子-内含子结构。GhAGP基因启动子区含有多个与植物激素、非生物胁迫响应相关的顺式作用元件。组织表达分析结果显示,GhAGP基因具有不同的组织表达模式。非生物胁迫下的表达分析表明,多数GhAGP基因响应低温、高温、盐和干旱胁迫诱导表达,其中GhAGPL1和GhAGPL7参与棉花对多种逆境胁迫的响应。【结论】明确了陆地棉AGPase基因家族成员的分布特征、结构特征以及系统进化特征,初步揭示了该家族基因在棉花响应外界环境胁迫中的功能,可为棉花淀粉性状的遗传改良和抗逆育种提供重要的候选基因资源。