新型阿卡斑病毒NSs蛋白生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】对新型阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)非结构蛋白(non-structura,NSs)进行生物信息学分析,进而制备抗多克隆抗体,为新型AKAV检测及功能研究提供必要材料。【方法】使用蛋白生物信息学在线分析网站,对新型AKAV NSs蛋白进行系统分析。克隆NSs全长基因,利用大肠杆菌表达系统表达NSs重组蛋白,优化蛋白诱导条件并分析重组蛋白的可溶性;收获破碎菌体,经8 mol/L尿素变性、Ni 2+-NTA亲和层析纯化、透析及浓缩后进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定;将纯化的重组NSs蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;应用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)测定多克隆抗体效价及特异反应性。【结果】生物信息学分析表明,NSs蛋白由91个氨基酸残基构成,等电点为12.10,属于碱性蛋白,不稳定指数约为79.04,平均亲水性为指数为―0.059,为不稳定的亲水蛋白;无跨膜区和信号肽,属于非分泌蛋白。试验成功构建了NSs蛋白原核表达载体pET-32a-NSs,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定显示,成功表达重组NSs蛋白,分子质量为29.3 ku,主要以包涵体形式存在,与生物信息学分析结果一致;制备的多克隆抗体效价可达1∶16384000,Western blotting和IFA结果表明所制备抗体能够与NSs蛋白发生特异性反应,具有较好的特异性。【结论】试验成功获得纯化的新型AKAV NSs蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性;制备获得效价高、特异性好的多克隆抗体,为后续新型AKAV疫苗开发、检测及NSs蛋白功能研究提供了基础。

赤羽病病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、灵敏的赤羽病病毒(Akabanediseasevirus,AKAV)核酸检测方法,以AKAV S基因为靶基因,设计特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应体系和条件,建立了AKAV荧光定量RT-PCR检测方法,随后开展了敏感性、特异性及重复性评估,并利用该方法与AKAV检疫行业标准推荐方法同时对临床采集的80份牛羊血液样品进行检测,以检验方法的临床应用效果。结果显示:本研究建立的检测方法敏感性较高,最低检测限为13.4 copies/μL;特异性良好,与口蹄疫病毒、牛冠状病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、牛白血病病毒等均无交叉反应;组内试验变异系数为0.93%~2.47%,组间试验为1.25%~2.76%,重复性良好;利用建立的方法从80份临床样品中检出AKAV阳性样品21份,该检测结果与AKAV检疫行业标准推荐方法的符合率为98.75%。结果表明,本研究建立的AKAV荧光定量RT-PCR检测方法敏感性高,特异性及重复性好,适用于赤羽病临床检测,为赤羽病病原学监测和诊断技术标准开发提供了技术支撑。

新型阿卡斑病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR建立及广西边境地区蚊携带新型阿卡斑病毒调查

【目的】建立检测新型阿卡斑病毒(AKAV)的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR,并结合序列测定开展广西边境地区蚊携带新型AKAV调查,了解其流行趋势及遗传进化特征,为建立重要蚊媒病毒病预警机制提供技术支持。【方法】分别针对新型AKAV的S基因和M基因主要变异位点设计引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR并通过Ct值、标准曲线斜率、相关系数、扩增效率及扩增准确性等指标确定最佳反应体系及扩增程序;以优化的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测2019年6-10月在广西边境地区采集的139份蚊样品,获得的新型AKAV经测序后采用ClustalW构建遗传进化树。【结果】SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR最佳反应体系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.0μL,上、下游引物(4μmol/L)各1.0μL,标准品或反转录产物2.0μL,双蒸水补齐至20.0μL。扩增程序:95℃预变性30 s;95℃30 s,64℃(S基因)/66℃(M基因)30 s,72℃30 s,进行40个循环。SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测新型AKAV S基因和M基因的极限为1.0×101copies/μL和1.0×102copies/μL,对应的扩增效率分别为98.61%和105.81%,但不能扩增蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌;检测S基因和M基因的批内重复试验、批间重复试验变异系数(CV)均低于5.00%。采用建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR成功从广西边境地区防城港市、东兴市、宁明县、大新县及北海市的阿蚊和库蚊中检出新型AKAV,且均属于基因Ia型,尤其与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性。【结论】针对新型AKAV S基因和M基因建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,更适用于检测病毒拷贝数低的样品。此外,从广西边境地区蚊样品中检出的AKAV毒株均为新型AKAV,属于基因Ia型,与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性,推测新型AKAV已在广西周边省份流行。

赤羽病SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法的建立和应用

本研究根据赤羽病毒(AKAV)的S基因序列设计合成了引物,RT-PCR扩增得到目的基因片段并克隆到PGM-T载体得到质粒标准品。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测AKAV的方法。该方法的检测敏感性达到926拷贝/25μL,并具有较好的重复性和特异性。本试验方法的建立对于加强进出口牛AKAV的检验检疫具有十分重要的意义。

牛传染性鼻气管炎和赤羽病基因芯片检测方法的建立和应用

为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和赤羽病病毒(AKAV)的双重快速检测方法,本研究根据IBRV gB基因和AKAV S基因序列设计合成了2对特异引物和探针,建立了同时检测这两种病毒的基因芯片检测方法,即以合成探针的5'端添加poly T10尾并氨基化固定于经处理的玻璃基片表面作为捕捉序列,采用荧光素Cy3标记正向引物的5'端,对样品的PCR扩增产物进行检测,并通过试验确定其适宜杂交温度为38℃。该方法检测IBRV和AKAV重组质粒的灵敏度分别为3.6×103拷贝/25μL和9.26×104拷贝/25μL,同时通过对牛的腺病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒及牛白血病病毒等的检测均无交叉反应,表明其特异性强。该检测方法的建立对于加强进出口牛的IBRV和AKAV检验检疫具有十分重要的意义。

多重PCR技术同时检测牛传染性鼻气管炎和赤羽病方法的建立和应用

为满足同时对IBRV和AKAV进行快速诊断的需要,根据牛疱疹病毒1型(BHV1)gB基因序列和赤羽病病毒(AKAV)的S基因序列,设计了2对针对这2种病毒的特异引物,并建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:该方法能同时扩增得到2条与试验设计相符的311 bp(IBRV)和392 bp(AKAV)特异性条带;IBRV的灵敏度为0.13 pg/25μL,AKAV的灵敏度为1.04 pg/25μL。本试验方法的建立对于加强进出口牛IBRV和AKAV的检验检疫具有十分重要的意义。

2022年云南省边境地区牛蓝舌病病毒及阿卡斑病毒抗体检测

为了解云南省边境地区牛蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)与阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)的流行与分布现状,2022年在云南省9个边境县(市)采集1 820份牛血清样本,应用c ELISA方法进行BTV与AKAV抗体检测,并对检测结果利用IBM SPSS Statistics 22、Excel 2007等软件进行区间、群间和时间的分类统计分析。结果显示:共检出BTV阳性样品1 207份,样品阳性率为66.32%(1 207/1 820);检出AKAV阳性样品350份,样品阳性率为32.17%(350/1 088)。各县(市、区)的BTV样品阳性率为43.50%~93.00%,AKAV为12.90%~50.00%,不同地区间的差异有统计学意义(P <0.01);黄牛和西门塔尔牛的BTV和AKAV抗体样品阳性率均高于水牛,入境牛BTV抗体阳性率显著高于本土牛,两组数据差异均有统计学意义(P <0.01);规模养殖场的BTV和AKAV抗体阳性率和散养户差异无统计学意义(P> 0.05);7-8月的BTV和AKAV抗体阳性率显著高于5-6月(P <0.01)。结果表明:BTV和AKAV在云南省边境地区已广泛存在,其感染有加重趋势;病原通过境外牛传入国内的风险不断增加,防控形势较为严峻。因此,云南省应继续加强边境地区BTV、AKAV等虫媒病毒的监控,并制定实施相应防控措施,以保障国内畜牧业健康发展。

赤羽病病毒套式RT-PCR检测方法的建立与初步应用

根据GenBank中已发表的赤羽病病毒(AKAV)的S基因序列,设计了3条特异性引物,建立了检测AKAV的套式RT-PCR方法。特异性试验表明,该方法可以特异扩增出AKAV的S基因片段,但从牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)等13种对照病毒中均不能扩增出目的条带。敏感性试验表明,套式RT-PCR能够扩增10-5稀释度的病毒RNA(核酸含量约1.18 ng/μL),比普通RT-PCR高出1 000倍。用此方法检测130份奶牛血清样品与1份流产胎儿病料,均未检测到阳性样本,但AKAV在血清模拟样品中可被有效检出。研究结果表明,该方法灵敏、特异,为AKAV的检测提供了一个快速、有效的手段。