USP5表达水平在急性髓系白血病中的意义及其对AKT/mTOR/4EBP1信号通路的调控作用研究

目的:探讨USP5在急性髓系白血病(AML)中的临床意义、功能作用和潜在下游机制。方法:基于TCGA数据库分析USP5在AML和正常组织中的表达及其与患者生存的相关性。利用慢病毒在Jurkat和HL-60细胞中敲低和过表达USP5,分别通过RT-qPCR和Western blot检测USP5 mRNA和蛋白的表达。通过CCK-8和甲基纤维素集落形成实验进行细胞增殖和生长检测,流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡。结果:与正常组织相比,USP5在AML中高表达,USP5的上调与AML患者的生存呈负相关。敲减和过表达USP5分别会抑制和促进AML细胞的增殖和集落生长。敲减USP5的Jurkat和HL-60细胞可导致细胞周期停滞和细胞凋亡,此外,敲除USP5可以抑制AKT、mTOR和4EBP1的磷酸化。结论:过表达USP5与AML患者的不良预后相关。靶向调控USP5可抑制AKT/mTOR/4EBP1信号传导,抑制AML细胞的增殖和生长。

藤黄健骨胶囊对膝骨关节炎鼠骨代谢指标及PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信号通路的影响

目的 探讨藤黄健骨胶囊对膝骨关节炎鼠骨代谢指标及PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信号通路的影响。方法 采用木瓜蛋白酶构建膝骨关节炎大鼠(KOA)模型,将造模成功的40只大鼠按随机数字表法分为模型组、阳性药物组、低剂量组和高剂量组,每组各10只。未造模的10只大鼠作为对照组。建模4周后,阳性药物组、低剂量组和高剂量组分别以美洛昔康水溶液、0.09 g/kg以及0.36 g/kg藤黄健骨胶囊干预,模型组和对照组以等量生理盐水灌胃,1次/d。给药4周后,观察比较各组大鼠Mankin评分及关节肿胀程度,酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测白介素-1β(Interleukin 1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、金属基质蛋白酶3(Metallomatrix proteinase 3,MMP3)、组织金属蛋白酶抑制因子-1(Tissue metalloproteinase inhibitor 1,TIMP-1)、骨钙素(Bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins,BGP)、抗洒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRACP)、I型胶原C端肽(Type I collagen carboxy-terminal peptide,CTX),Western blot法检测软骨组织PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达情况。结果 HE染色结果显示,对照组大鼠关节面、关节软骨和软骨细胞均正常;而模型组关节面呈不规则,关节软骨含少量软骨细胞或软骨细胞坏死,且关节软骨被纤维组织取代阳性药物组和高剂量组关节表面不规则,软骨细胞数量减少,而低剂量组显示软骨细胞中度坏死。与对照组比较,模型组Mankin评分、关节肿胀程度均升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,阳性药物组、高剂量组、低剂量组Mankin评分、关节肿胀程度均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);且各药物组Mankin评分及关节肿胀程度比较,阳性药物组<高剂量组<低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组IL-1β、TNF-α、MMP-3、TIMP-1水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,阳性药物组、高剂量组、低剂量组IL-1β、TNF-α、MMP-3、TIMP-1水平均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);且各药物组IL-1β、TNF-α、MMP-3、TIMP-1水平比较,阳性药物组<高剂量组<低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组,模型组TRACP、CTX水平均升高,BGP水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,阳性药物组、高剂量组、低剂量组TRACP、CTX水平明显降低,BGP水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);且各药物组TRACP、CTX水平比较,阳性药物组<高剂量组<低剂量组,BGP水平比较,阳性药物组>高剂量组>低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组PI3K、Akt、Nrf2、HO-1蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,阳性药物组、高剂量组、低剂量组PI3K、Akt、Nrf2、HO-1蛋白水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);且各药物组PI3K、Akt、Nrf2、HO-1蛋白水平比较,阳性药物组>高剂量组>低剂量组,差异有统计学意(P<0.05)。结论 藤黄健骨胶囊可显著改善膝骨关节炎鼠骨代谢水平,缓解膝骨关节炎症状,其可能机制与激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信号通路有关。

PI3K/Akt/FoxO1信号通路对人源肺动脉平滑肌细胞及肺动脉高压大鼠细胞凋亡的影响

目的探究磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头框蛋白O1(FoxO1)信号通路对人源肺动脉平滑肌细胞(hPASMC)及肺动脉高压大鼠细胞凋亡的影响。方法细胞实验部分,将hPASMC分为4组:(1)空白对照组;(2)血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)组;(3)PDGF-BB+LY294002组;(4)PDGF-BB+紫杉醇(paclitaxel)组。采用TUNEL检测细胞凋亡,采用蛋白质印迹法检测Bcl-2、裂解的胱天蛋白酶-3(cleaved caspase-3)和PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平。动物实验部分,将12只SD大鼠随机分为4组:(1)空白对照组;(2)野百合碱(MCT)组;(3)MCT+LY294002组;(4)MCT+paclitaxel组。采用Western blot检测Bcl-2、cleaved caspase-3和PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平。结果细胞实验部分:相比于PDGF-BB组,PDGF-BB+LY294002组与PDGF-BB+paclitaxel组的Bcl-2表达水平下降(P<0.01),cleaved caspase-3表达水平上升(P<0.01);相比于空白对照组,PDGF-BB+LY294002组与PDGF-BB+paclitaxel组的凋亡率增加(P<0.01)。动物实验部分:相比于MCT组,MCT+LY294002组与MCT+paclitaxel组Bcl-2、磷酸化Akt与磷酸化FoxO1表达水平下降(P<0.01),cleaved caspase-3与FoxO1表达水平上升(P<0.01)。各组之间PI3K表达水平无显著差异。结论PI3K/Akt/FoxO1信号通路抑制hPASMC与肺动脉高压大鼠肺组织的细胞凋亡。

瓜蒌皮总皂苷调节PI3K/Akt/SIRT1信号通路减轻慢性阻塞性肺疾病大鼠的气道炎症

目的探讨瓜蒌皮总皂苷通过调节PI3K/Akt/SIRT1信号通路对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠气道炎症的影响。方法SD大鼠按照随机数字表法随机分成5组:对照组、模型组、瓜蒌皮总皂苷(300 mg/kg)组、LY294002(PI3K抑制剂,0.3 mg/kg)组、瓜蒌皮总皂苷(300 mg/kg)+LY294002(0.3 mg/kg)组,每组12只。除对照组外,其他组大鼠均构建COPD大鼠模型并给予药物干预。药物干预24 h后,检测5组大鼠肺功能;采用Giemsa染色进行肺泡灌洗液(BALF)中白细胞分类计数;HE染色观察5组大鼠肺组织病理形态变化,评测其损伤情况;试剂盒检测5组大鼠BALF上清液和血清中IL-18、IL-17水平;免疫印迹法检测各组大鼠肺组织中PI3K/Akt/SIRT1信号通路蛋白表达。结果与对照组大鼠的MV、PEF、Ri、白细胞数量、BALF上清液和血清中IL-18和IL-17水平、肺组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及SIRT1蛋白相对表达水平相比,模型组大鼠肺组织出现明显病理损伤,Ri、白细胞数量、BALF上清液和血清中IL-18和IL-17水平显著升高(P<0.05),MV、PEF、肺组织p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt及SIRT1蛋白相对表达显著降低(P<0.05)。与模型组和瓜蒌皮总皂苷+LY294002组大鼠的MV、PEF、Ri、白细胞数量、BALF上清液和血清中IL-18和IL-17水平、肺组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及SIRT1蛋白相对表达水平相比,瓜蒌皮总皂苷组大鼠肺组织病理损伤症状均减轻,Ri、白细胞数量、BALF上清液和血清中IL-18和IL-17水平均降低(P<0.05),MV、PEF、肺组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及SIRT1蛋白相对表达均升高(P<0.05);LY294002组大鼠肺组织病理损伤症状均加重,Ri、白细胞数量、BALF上清液和血清中IL-18和IL-17水平均升高(P<0.05),MV、PEF、肺组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及SIRT1蛋白蛋白相对表达均降低(P<0.05)。结论瓜蒌皮总皂苷可能通过激活PI3K/Akt/SIRT1信号通路,减轻COPD大鼠气道炎症,改善肺组织损伤,修复肺功能。

地奥心血康激活IRS-1/PI3K/Akt信号通路改善非酒精性脂肪性肝炎小鼠胰岛素抵抗的实验研究

目的:研究地奥心血康(DXXK)对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠胰岛素抵抗的影响及作用机制。方法:C57BL/6J小鼠随机分为正常组和造模组,造模组高脂饲料饲喂16周后随机分为模型组、吡格列酮组(6.0 mg·kg^(-1)·d^(-1)),DXXK高、中、低(200、60、20 mg·kg^(-1)·d^(-1))剂量组,每组8只,灌胃给药连续8周。检测小鼠体质量、活动度、脂肪质量、空腹血糖(FBG)、血清胰岛素(FINS)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平及肝脏中的TC、TG含量;口服葡萄糖耐量实验(OGTT)、腹腔胰岛素耐量实验(IPITT),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、胰岛素敏感指数(ISI)、OGTT和IPITT的曲线下面积(AUC);HE染色观察肝脏病理、油红O染色观察肝脏脂质蓄积情况;Western blot法检测肝脏组织IRS-1/PI3K/Akt信号通路中相关蛋白及下游靶标甾醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)蛋白水平。结果:与模型组比较,DXXK组和吡格列酮组小鼠的体质量、脂肪质量、FBG、FINS、HOMA-IR、ISI、TC、TG、AST、ALT水平、OGTT和IPITT的AUC均显著降低(P<0.05,P<0.01),活动度显著升高,肝脏脂质沉积和肝功能异常明显改善(P<0.05,P<0.01),肝细胞脂肪变性和气球样变明显减轻,肝脏p-IRS-1/IRS-1、PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达显著上调,SREBP-1c蛋白表达显著下降(P<0.05,P<0.01)。结论:DXXK可以改善NASH小鼠的胰岛素抵抗,其作用机制可能与激活IRS-1/PI3K/Akt信号通路有关。

水仙环素通过调控PLK1/AKT信号通路诱导三阴性乳腺癌细胞周期阻滞和凋亡

目的研究水仙环素(Nas)对人三阴性乳腺癌(TNBC)细胞周期和凋亡的抑制作用及分子机制。方法采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)、克隆形成、Transwell、流式细胞术等实验分析Nas对TNBC细胞株MDA-MB-231细胞增殖和侵袭能力的抑制作用,及对细胞周期和凋亡的诱导作用;利用免疫印迹(WB)实验分析Nas对MDA-MB-231细胞株cle-Caspase-3、PARP、cle-PARP、PLK1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、CDK1、Cyclin B、Cyclin A、p-21、p-27、p-62、LC3、γ-H2AX等蛋白质的影响。结果不同浓度(0.5、1.0、2.0μmol/L)Nas能抑制MDA-MB-231细胞株的克隆形成(48 h抑制率分别为15.99%、24.76%和54.17%)、侵袭能力(48 h抑制率分别为0.68%、23.20%和45.27%),可将细胞周期阻滞于G2期(48 h阻滞率分别为75.50%、140.56%和316.06%),可对细胞凋亡起到诱导作用(48 h凋亡诱导率分别为105.39%、199.73%和375.74%;72 h凋亡诱导率分别为104.45%、244.96%和709.60%)。分子机制实验显示,Nas可以显著促进cle-Caspase-3、cle-PARP、p-21、p-27及γ-H2AX等蛋白质的表达,显著抑制PLK1、p-PI3K、p-AKT、CDK1、Cyclin B等蛋白质的表达水平,而对p-62、LC3-Ⅱ/Ⅰ等蛋白质的表达水平影响不明显。结论Nas能抑制MDA-MB-231细胞株的克隆形成、侵袭能力,对凋亡起到诱导作用,并将细胞周期阻滞于G2期,该机制可能通过调节PLK1/AKT信号通路来实现。

组胺H 1受体激动剂通过Akt/NF-κB通路抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞炎症反应

目的探讨组胺H 1受体(histamine H 1 receptor,H 1R)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的星形胶质细胞炎症反应的影响及其调控机制。方法采用LPS建立体外星形胶质细胞炎症模型,随机将大鼠原代星形胶质细胞分为对照组、LPS组、LPS+H 1R激动剂组(2-pyridylethlamine,Pyri)和H 1R激动剂组。对照组仅加入培养液,LPS+H 1R激动剂组提前在培养液中加入100μmol·L-1的Pyri,1 h后再加入终浓度为100μg·L-1的LPS。CCK-8法检测细胞活性;免疫荧光法检测活化标记物GFAP和H 1R的表达;倒置相差显微镜下观察星形胶质细胞的形态变化;ELISA法检测细胞上清中炎症因子TNF-α和IL-6水平;Western blot检测p-Akt、Akt、p-NF-κB p65、NF-κB p65的蛋白表达。结果与对照组比较,LPS组星形胶质细胞分支和辐射状突起减少,GFAP表达增加,细胞表面H 1R表达下调,上清液中TNF-α和IL-6含量增加,Akt和NF-κB p65的磷酸化水平明显增加;与LPS组相比,LPS+H 1R激动剂组激活态星形胶质细胞减少,GFAP表达降低,培养基上清中TNF-α和IL-6的含量明显下降,Akt和NF-κB p65的磷酸化表达明显降低。结论H 1R激动剂能够抑制LPS诱导的星形胶质细胞活化和炎症因子的表达,且Akt/NF-κB通路可能是H 1R参与星形胶质细胞免疫调节的重要途径。

miR-106a通过调控PI3K/PDK1/AKT蛋白通路调节胃癌细胞生物学行为的研究

目的探讨miR-106a对胃癌细胞生物学行为的影响及其作用机制。方法选取AGS人胃癌细胞系,经培养后分为27个样本。所有样本随机分为miR-106a inhibitor、miR-mimic、miR-NC共计3组,分别给予miR-106a抑制剂、miR-106a模拟物及安慰剂干预。观察各组细胞存活率、细胞周期、细胞侵袭、迁移及caspase活性、Bax、Bcl-2、Casepase-3蛋白相对表达量、p85β、p-PDK1、p-AKT蛋白相对表达量。结果与miR-NC组比较,miR-106a inhibitor组AGS细胞活性降低[(分别为15.01±0.97)、(69.82±2.31)%](P<0.01);miR-106a mimics组AGS细胞G0/G1期细胞比例降低(P<0.05)(分别为17.33±1.04、58.24±0.82),G2/M和S期细胞比例升高(分别为50.11±1.12、35.64±1.07和31.56±0.92、9.24±0.25);miR-106a inhibitor组AGS细胞G0/G1期细胞比例升高(分别为78.43±1.12、58.24±0.82)(P<0.05),G2/M和S期细胞比例降低(分别为33.65±0.99、35.64±1.07和19.78±0.84、9.24±0.25)(P<0.01)。与miR-NC相比,miR-106a mimics组AGS细胞的迁移、侵袭能力增强,miR-106a inhibitor组AGS细胞的迁移、侵袭能力减弱(P<0.01);与miR-NC相比,miR-106a mimics组AGS细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9活性降低,miR-106a inhibitor组AGS细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9活性升高(P<0.05);miR-NC相比,miR-106a mimics组AGS细胞Bax(分别为0.69±0.07、1.48±0.15)、Casepase-3蛋白(分别为0.37±0.04、0.91±0.09)相对表达量降低,Bcl-2蛋白相对表达量升高(分别为1.53±0.12、0.94±0.09),miR-106a inhibitor组AGS细胞Bax(分别为2.07±0.21、1.48±0.15)、Casepase-3蛋白(分别为1.23±0.12、0.91±0.09)相对表达量升高,Bcl-2蛋白相对表达量降低(P<0.05)(分别为0.65±0.07、0.94±0.09);与miR-NC相比,miR-106a mimics组AGS细胞p85β(分别为1.24±0.12、0.94±0.09)、p-PDK1(分别为2.13±0.23、1.01±0.10)、p-AKT蛋白(分别为1.14±0.11、0.72±0.06)相对表达量升高,miR-106a inhibitor组AGS细胞p85β(分别为0.69±0.07、0.94±0.09)、p-PDK1(分别为0.75±0.07、1.01±0.10)、p-AKT(分别为0.53±0.05、0.72±0.06)相对表达量降低(P<0.05)。结论miRNA-106a表达能通过调控宫颈癌细胞PI3K/PDK1/AKT蛋白通路调控其细胞生物学行为,包括降低癌细胞活力、迁移和侵袭,诱导癌细胞细胞周期停滞,抑制miRNA-106a表达可能是胃癌患者治疗的新靶点之一。

基于PI3K/Akt/FoxO1通路探讨大黄酸对2型糖尿病大鼠肾损伤的作用

目的 通过PI3K/Akt/FoxO1信号传导通路探讨大黄酸对链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠肾脏损伤的作用。方法 通过高脂饮食+小剂量STZ(35 mg/kg)造模,将2型糖尿病大鼠随机分为大黄酸低、高(75、150 mg/kg)剂量组,二甲双胍组(300 mg/kg),模型组,另设正常对照组。连续给药12周后,检测各组大鼠的血糖、体质量、肾脏指数、MDA水平、SOD和GSH-Px活性,HE染色观察各组大鼠肾组织病理形态学改变,Masson三色染色观察胶原表达,免疫组化法与Western blot法检测大鼠肾脏PI3K、Akt与FoxO1蛋白表达。结果 与正常组比较,模型组大鼠体质量、SOD和GSH-Px活性、FoxO1蛋白表达降低(P<0.05),血糖、肾脏指数、肾组织MDA水平和PI3K、Akt蛋白表达升高(P<0.05),肾脏有明显病变损伤;与模型组比较,大黄酸各剂量组体质量、SOD和GSH-Px活性、FoxO1蛋白表达升高(P<0.05),血糖、肾脏指数、肾组织MDA水平和PI3K、Akt蛋白表达降低(P<0.05),肾脏病理损伤得到改善。结论 大黄酸对2型糖尿病大鼠肾脏有保护作用,其机制可能与减轻肾脏氧化应激及调节肾脏PI3K/Akt/FoxO1信号转导通路有关。

基于胰腺PI3K/AKT/BMAL1通路探讨针刺对2型糖尿病大鼠血糖昼夜节律的影响

[目的]通过观察PI3K/AKT/BMAL1通路相关蛋白的表达变化及针刺效应,探讨调理脾胃针法调节2型糖尿病大鼠血糖昼夜节律的作用机制。[方法]将36只SPF级雄性SD大鼠采用随机数字表法分为空白组(10只),造模组(26只)。造模组以高脂高糖喂养2个月,而后采用小剂量(25 mg/kg)腹腔注射链脲佐菌素的方法建立2型糖尿病大鼠针刺效应平台。并将造模成功的20只大鼠随机分为针刺组(10只),模型组(10只)。针刺组采用“调理脾胃针法”针刺,每日治疗1次,每周治疗5次,共治疗4周。空白组及模型组不进行干预。主要观察治疗前后大鼠4时相(0、6、12、18时)血糖变化及平均血糖的标准差(SDBG)、最大血糖波动幅度(LAGE);以酶联免疫吸附法(ELISA)检测治疗前后空腹血清胰岛素含量;以胰腺荧光TUNEL染色观察治疗后胰岛细胞凋亡情况,计算凋亡指数(AI);以蛋白质印迹法(Western blot)检测治疗后磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)及p-AKT、脑和肌肉芳香烃受体核转位蛋白1(BMAL1)表达。[结果]干预后与空白组比较,模型组各时相血糖、SDBG、LAGE仍然显著升高,空腹血清胰岛素(Fins)含量显著降低(P<0.01),但针刺组与模型组比较,各时相血糖、SDBG、LAGE显著下降,Fins含量显著升高(P<0.01);与模型组相比,针刺可明显改善胰岛细胞的凋亡,降低AI值;干预后与模型组比较,针刺组各蛋白(PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1)表达均显著升高(P<0.01)。[结论]调理脾胃针法可改善2型糖尿病大鼠血糖昼夜节律,机制与上调胰腺PI3K/AKT/BMAL1相关蛋白表达相关。

BMI-1通过激活PI3K/Akt信号通路促进裸鼠体内淋巴瘤生长的机制研究

目的:探讨原癌基因BMI-1对裸鼠体内淋巴瘤生长的影响及潜在分子机制。方法:培养鼠源淋巴瘤细胞FOX-NY,并对细胞进行BMI-1沉默和过表达处理,以及联合PI3K/Akt抑制剂处理。CCK-8法检测各组细胞增殖情况。通过腋窝下接种鼠源淋巴瘤细胞FOX-NY、沉默BMI-1的FOX-NY(BMI-1^(-)-FOX-NY)、过表达BMI-1的FOX-NY(BMI-1^(+)-FOX-NY)建立裸鼠淋巴瘤动物模型。裸鼠分为:对照组、质粒空载组、BMI-1^(-)-FOX-NY组、BMI-1^(+)-FOX-NY组。对裸鼠体重、肿瘤体积和质量等指标进行检测。采用PCR技术测定裸鼠体内BMI-1 mRNA表达。采用苏木精-伊红(HE)染色观察肿瘤组织病理学情况。采用免疫组化染色和蛋白印迹检测裸鼠瘤体BMI-1、p-PI3K、p-Akt蛋白表达。结果:和空载组相比,BMI-1^(-)组细胞增殖能力显著降低,BMI-1^(+)组细胞增殖能力显著升高。和BMI-1^(+)组细胞相比,BMI-1^(+)-Miltefosine组细胞增殖能力显著降低。与空载组比较,BMI-1^(-)-FOX-NY组裸鼠体重显著降低(P<0.001)、肿瘤体积显著减小(P<0.001)、肿瘤组织病理学显著改善,瘤体BMI-1 mRNA水平显著降低(P<0.001)、瘤体BMI-1、p-PI3K、p-Akt蛋白水平显著降低(P<0.001)。反之,BMI-1^(+)-FOX-NY组裸鼠体重显著增加(P<0.01)、肿瘤体积显著增加(P<0.01,P<0.001)、肿瘤组织病理学显著恶化,瘤体BMI-1 mRNA水平显著升高(P<0.001)、瘤体BMI-1、p-PI3K、p-Akt蛋白水平显著升高(P<0.01,P<0.001)。结论:BMI-1在淋巴瘤组织中表达显著升高,BMI-1可以促进DLBCL的生长并激活PI3K/Akt信号通路。

miR-21靶向PTEN调控AKT/FoxO1信号通路对胃癌细胞凋亡的机制研究

目的:探究miR-21靶向PTEN调控AKT/FoxO1信号通路对胃癌细胞凋亡的影响。方法:将胃癌SGC-7901细胞分为miR-NC inhibitors组(SGC-7901细胞中转染miR-NC inhibitors质粒)、miR-21 inhibitors组(SGC-7901细胞中转染miR-21 inhibitors质粒)、miR-21 inhibitors+sh-PTEN组(SGC-7901细胞中转染miR-21 inhibitors和sh-PTEN质粒);Control组(不转染任何质粒的SGC-7901细胞)。qRT-PCR检测细胞中miR-21 mRNA表达;采用CCK-8、Transwell小室法和流式细胞仪检测细胞增殖、侵袭能力和凋亡率;蛋白质印迹检测细胞中PTEN、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、FoxO1蛋白表达;双荧光素酶报告检测miR-21和PTEN的靶向关系。结果:人正常胃黏膜上皮细胞GES-1(1.00±0.10)相比,胃癌细胞SGC-7901中miR-21(1.89±0.17)表达明显升高(P<0.05)。Control组相比,miR-21 inhibitors组细胞中miR-21表达(0.83±0.10)、增殖率(45.31±4.92)%、侵袭数目(62.34±5.83)个和p-PI3K/PI3K(0.42±0.05)、p-AKT/AKT(0.51±0.05)比值均明显降低,细胞凋亡率(23.48±3.51)%、PTEN(0.98±0.10)和FoxO1(0.76±0.08)蛋白表达明显升高(P<0.0001)。pcDNA-NC组相比,pcDNA-PTEN组细胞增殖率(48.26±5.01)、侵袭细胞数(65.37±6.02)个和细胞中p-PI3K/PI3K(0.46±0.05)、p-AKT/AKT(0.55±0.06)比值均明显降低,细胞凋亡率(25.61±3.27)%及细胞中PTEN(0.91±0.09)和FoxO1(0.70±0.08)蛋白表达升高(P<0.05)。预测发现PTEN的3'UTR端与miR-21有碱基互补结合点位。miR-NC组相比,转染野生型PTEN(PTEN-WT)时miR-21组(0.32±0.03)荧光素酶活性明显降低(P<0.05)。miR-21 inhibitors组相比,miR-21 inhibitors+sh-PTEN组细胞增殖率(90.25±9.14)%和侵袭细胞数(125.69±10.31)个和细胞中p-PI3K/PI3K(0.80±0.08)、p-AKT/AKT(0.76±0.08)比值明显增加,细胞凋亡率(6.24±1.32)和细胞中PTEN(0.30±0.04)、FoxO1(0.38±0.05)蛋白表达降低(P<0.0001)。结论:敲减miR-21可靶向负调控PTEN表达,调控AKT/FoxO1信号通路,抑制胃癌细胞的增殖和侵袭,促进凋亡。

淫羊藿苷基于PLCγ1/AKT/eNOS/NO信号通路改善大鼠少弱精症

目的:探究淫羊藿苷对少弱精症的治疗作用及其作用机制。方法:以奥硝唑(800 mg/kg)所致少弱精症大鼠为动物模型,以淫羊藿苷(50、100 mg/kg)及左卡尼汀(100 mg/kg)干预。称量生殖器官质量,统计实验产仔率,分析附睾精子密度和精子活力;ELISA试剂盒检测血清睾酮含量;苏木精-伊红(HE)观察各组大鼠睾丸组织病理学;免疫荧光染色检测生精小管Sertoli细胞数量;试剂盒测定血清NO含量;Western Blot检测睾丸p-PLCγ1、p-AKT、p-eNOS表达。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠睾丸指数、附睾指数、产仔率、附睾精子密度、附睾精子活力、血清睾酮含量、睾丸组织NO含量、生精小管直径及Sertoli细胞数量和睾丸组织PLCγ1、AKT、eNOS蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,淫羊藿苷100 mg/kg组大鼠睾丸指数、附睾指数、产仔率、附睾精子密度、附睾精子活力、血清睾酮含量、睾丸组织NO含量、生精小管直径及Sertoli细胞数量和睾丸组织PLCγ1、AKT、eNOS蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.01)。结论:淫羊藿苷可以改善少弱精症,其机制可能与PLCγ1/AKT/eNOS/NO通路有关。

心痛泰含药血清干预PI3K/Akt/HIF-1α通路抑制兔主动脉平滑肌细胞凋亡的作用机制

目的通过生信分析和细胞实验探讨心痛泰含药血清干预PI3K/Akt/HIF-1α对兔主动脉平滑肌细胞(Aortic vascular smooth muscle cell,VSMC)凋亡的作用机制。方法采用ox-LDL诱导实验兔主动脉平滑肌细胞凋亡,构建动脉粥样硬化的细胞模型。采用细胞增殖与活性检测(Cell counting Kit8,CCK8)法筛选心痛泰含药血清最佳作用浓度。在中药药理数据分析平台中收集心痛泰的主要化学成分,通过PubChem数据库收集各活性化合物成分信息,SwissTargetPrediction数据库预测活性化合物相关靶点,通过GeneCards和DisGeNET数据库收集“动脉粥样硬化”、“细胞凋亡”的作用靶点,STRING平台构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction network,PPI)网络,DAVID在线分析GO分析和KEGG分析。VSMC分为空白血清组、模型组、心痛泰含药血清组、磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)抑制剂(LY294002)组、心痛泰含药血清+LY294002组。分别采用原位末端标记(TdT mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)法和流式细胞术检测VSMC凋亡,计算凋亡率;聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)法测定PI3K、丝/苏氨酸蛋白激酶(Phospho-Alpha serine/threonine-protein kinase,Akt)、缺氧诱导因子(Hypoxia-Inducible factor 1-Alpha,HIF-1α)、caspase-3、caspase-9的mRNA表达;蛋白质免疫印迹(Western blot)法测定磷酸化的PI3K(p-PI3K)/PI3K、磷酸化的Akt(p-Akt)/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白表达;细胞免疫荧光法检测VSMC中收缩型特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的荧光定量。结果CCK-8筛选出最佳干预浓度为20%心痛泰中剂量含药血清;TUNEL法和流式细胞术表明,与空白组相比,模型组的VSMC凋亡阳性细胞百分比、早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均明显升高(P<0.01),PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9 mRNA表达明显增加(P<0.01),p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表达明显增加(P<0.01),α-SMA明显减少(P<0.01)。与模型组相比,心痛泰含药血清组、LY294002组、心痛泰含药血清+LY294002组的VSMC凋亡阳性细胞百分比、早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均降低(P<0.01或P<0.05),PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9 mRNA表达减少(P<0.01或P<0.05),p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表达下调(P<0.01或P<0.05),α-SMA明显增加(P<0.01或P<0.05)。与心痛泰含药血清组比,心痛泰含药血清+LY294002组的VSMC凋亡阳性细胞百分比、早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均无明显差异(P>0.05),PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的mRNA表达,以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表达无差异(P>0.05),α-SMA的荧光强度无差异(P>0.05)。结论心痛泰含药血清可能通过下调PI3K/Akt/HIF-1α信号通路及下游的凋亡相关因子,改善ox-LDL诱导的VSMC凋亡,从而达到稳定动脉易损斑块的作用。

DJ-1过表达通过PTEN/Akt通路促进人胃癌MGC803细胞的增殖、迁移、侵袭与上皮间质转化

目的:探讨DJ-1基因过表达对人胃癌MGC803细胞增殖、迁移、侵袭与上皮间质转化(EMT)的影响及其机制。方法:利用基因转染技术构建DJ-1基因过表达MGC803细胞,实验分为MGC803、空载体和DJ-1过表达组。采用MTT、平板克隆形成、细胞划痕和Transwell实验分别检测DJ-1过表达对MGC803细胞增殖、克隆形成、迁移与侵袭的影响;qPCR和WB法检测DJ-1过表达对各组细胞DJ-1、PTEN、Akt、p-Akt、Snail、vimentin、E-cadherin、MMP-9与TIMP-3表达的影响,相差显微镜下观察MGC803细胞形态学的变化。裸鼠荷瘤实验检测DJ-1过表达对MGC803细胞移植瘤体内生长的影响。结果:成功构建DJ-1基因稳定过表达的MGC803细胞。与MGC803组和空载体组比较,DJ-1过表达组细胞的增殖能力与克隆形成数均显著增加(均P<0.05),细胞迁移距离明显增加、划痕距离明显缩短(均P<0.05),迁移与侵袭细胞数显著增多(均P<0.05),DJ-1 mRNA与蛋白表达明显上调、PTEN mRNA与蛋白表达下调(均P<0.05),Akt总蛋白各组比较无明显差异(均P>0.05),p-Akt蛋白表达明显上调(P<0.05),Snail、vimentin与MMP-9表达上调、E-cadherin与TIMP-3表达下调(均P<0.05)。相差显微镜下见长梭形细胞数目增多,圆形与椭圆形细胞减少,异型性更为明显。荷瘤裸鼠体内实验结果表明,与MGC803组相比较,DJ-1过表达组MGC803细胞移植瘤生长速度明显加快、移植瘤质量显著增加(均P<0.05)。结论:DJ-1过表达可通过PTEN/Akt通路在体内外抑制MGC803细胞的增殖、迁移、侵袭与EMT。

NHE1通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调节肺癌免疫抑制及对癌细胞的作用

目的探究钠氢交换蛋白1(Na[+]/H[+]hydrogen exchanger 1,NHE1)通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调节肺癌免疫抑制及对癌细胞的作用。方法将肺癌细胞在梯度浓度Cariporide下孵育,并计算得到Cariporide的IC50值为34 mmol/L。将细胞分为对照组(0 mmol/L)、低剂量Cariporide组(17 mmol/L)、中剂量Cariporide组(34 mmol/L)和高剂量Cariporide组(68 mmol/L)。培养48 h后分别通过克隆形成、划痕愈合的实验和Transwell测定细胞增殖、迁移和侵袭。并通过皮下注射手段对裸鼠模型构建30只,分为对照组、CariporideⅠ组和CariporideⅡ组(N=10),通过腹腔注射Cariporide(3 mg/kg,6 mg/kg)干预。建模28 d后处死小鼠检测肿瘤生长情况,通过Western blot检测增殖和转移相关蛋白。通过流式细胞术检测CD_(4)^(+)、CD_(8)^(+)细胞水平。结果4组细胞的增殖、迁移、侵袭以及PI3K/AKT/mTOR通路中蛋白表达水平比较,有统计学差异(P<0.05)。对照组、低剂量Cariporide组、中剂量Cariporide组和高剂量Cariporide组的克隆形成数目、划痕前缘迁移距离和侵袭细胞数目均依次逐渐降低(P<0.05)。3组小鼠的肿瘤体积、质量、增殖和转移相关蛋白水平以及CD_(4)^(+)和CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)水平比较,差异显著(P<0.05)。CariporideⅠ组和CariporideⅡ组的肿瘤体积和质量均显著低于对照组(P<0.05),CyclinD1、Ki67、MMP2、MMP9的水平显著低于对照组(P<0.05),CD_(4)^(+)和CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)的水平显著高于对照组(P<0.05);CariporideⅡ组的肿瘤体积、质量、CyclinD1、Ki67、MMP2、MMP9的水平显著低于CariporideⅠ组,而CD_(4)^(+)和CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)显著高于CariporideⅠ组(P<0.05)。结论使用Cariporide抑制NHE1可通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路抑制肺癌细胞的增殖和转移,并解除免疫抑制,从而发挥抗癌作用。

LncRNA MALAT-1靶向microRNA-370-3p调节Akt通路对肺癌细胞生物学行为影响的机制研究

目的 探讨长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录因子-1(LncRNA MALAT-1)是否能靶向调节microRNA-370-3p(miR-370-3p)的表达,以及对Akt通路和肺癌细胞生物学行为的影响。方法 选用非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞体外培养,分别抑制LncRNA MALAT-1(转染si-MALAT-1)或过表达miR-370-3p(转染miR-370-3p mimic),抑制LncRNA MALAT-1和干扰miR-370-3p(同时转染si-MALAT-1和antimiR-370-3p),观察A549细胞的生物学行为和Akt通路蛋白的表达。qRT-PCR检测LncRNA MALAT-1、miR-370-3p mRNA的表达;MMT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell实验检测细胞迁移与侵袭;Western blotting检测Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白相对表达量。构建MALAT-1野生型(MALAT-1WT_1uc)与突变型(MALAT-1MUT_1uc)荧光素酶报告基因质粒并分别与miR-370-3p、miR-NC转染至A549细胞,观察荧光结合强度并检测miR-370-3p的表达。结果 抑制LncRNA MALAT-1或过表达miR-370-3p能抑制A549细胞迁移、侵袭,促进细胞凋亡,减少A549细胞活性(P <0.05),并下调p-Akt和p-PI3K蛋白的表达(P <0.05)。与单纯抑制LncRNA MALAT-1比较,抑制LncRNA MALAT-1并干扰miR-370-3p能促进A549细胞迁移、侵袭,抑制细胞凋亡,增加A549细胞活性(P <0.05),并上调p-Akt和p-PI3K蛋白的表达(P <0.05)。TargetScan靶基因预测发现LncRNA MALAT-1与miR-370-3p存在结合位点,荧光素酶报告基因实验验证发现,与MALAT-1WT_1uc+Control组和MALAT-1WT_1uc+miR NC组比较,MALAT-1WT_1uc+miR-370-3p组相对荧光强度下降(P <0.05),MALAT-1MUT_1uc+miR-370-3p荧光强度无变化(P>0.05),进一步qRT-PCR结果发现,与Control组比较,si-MALAT-1组的miR-370-3p mRNA相对表达量升高(P <0.05),与si-MALAT-1组比较,si-MALAT-1+anti-miR-370-3p组的miR-370-3pmRNA相对表达量降低(P <0.05)。结论LncRNA MALAT-1可以靶向负调控miR-370-3p。抑制LncRNA MALAT-1可以上调miR-370-3p的表达,抑制A549细胞的增殖、迁移及侵袭,促进A549细胞的凋亡,并下调Akt通路蛋白的磷酸化。

针刺足三里通过调控ROCK1/AKT信号通路防治脓毒症致肌萎缩的作用机制

目的探讨针刺足三里通过Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)/蛋白激酶B(AKT)信号通路防治脓毒症后肌萎缩的作用及机制。方法8周龄SPF级雄性小鼠45只,随机分为3组,分别为对照(Sham)组、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)组、针刺(LPS+acupuncture)组,其中LPS组和针刺组分别给予腹腔注射LPS诱导脓毒症模型,对照组腹腔注射等体积生理盐水。苏木素-依红染色法检测小鼠肌肉组织结构变化;酶联免疫吸附剂测定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定促炎因子白细胞介素1β(Interleukin1β,IL-1β)、白细胞介素(Interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),抗炎因子白细胞介素10(Interleukin 10,IL-10)、转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β),以及骨骼肌损伤相关指标肌红蛋白(Myoglobin,MYO)、肌酸激酶MB同工酶(Creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)的变化;实时荧光定量反转录聚合酶链反应(Real-time PCR,RT-PCR)检测小鼠肌肉分解相关指标半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-8(Caspase-8)相关基因mRNA的表达水平;蛋白免疫印迹(Western blot,WB)法检测小鼠肌肉组织中ROCK1、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)的表达。结果与对照组相比,LPS组小鼠肌肉组织纤维可见出现断裂、坏死,促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均呈显著上升(P<0.01),抗炎因子IL-10、TGF-β水平均呈显著降低(P<0.01),骨骼肌损伤相关指标MYO、CK-MB的水平均显著升高(P<0.01),Caspase-3、Caspase-8 mRNA水平均显著升高(P<0.01),p-AKT和ROCK1蛋白表达水平均显著升高(P<0.01);与LPS组小鼠相比,针刺组小鼠肌肉结构相对完整,促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均呈显著降低(P<0.01),抗炎因子IL-10、TGF-β水平均呈显著升高(P<0.01),MYO、CK-MB的水平显著降低(P<0.01),Caspase-3、Caspase-8的mRNA水平显著降低(P<0.01),p-AKT和ROCK1的蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论针刺足三里可以有效地防治脓毒症肌萎缩,其作用机制可能是通过ROCK1/AKT信号通路来实现。

基于IGF-1R/PI3K/AKT的益气固表丸对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的影响及作用机制研究

目的:益气固表丸对慢性阻塞性肺疾病(COPD)有明显的治疗作用,但具体作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨益气固表丸对脂多糖(LPS)联合烟雾暴露构建慢性阻塞性肺病模型大鼠的治疗作用机制。方法:通过大鼠气管内灌注LPS和吸入香烟烟雾构建慢性阻塞性肺病模型,同时给予模型大鼠低、中、高剂量益气固表丸治疗14 d。观察呼吸参数及肺组织病理变化。采用酶联免疫吸附试验测定支气管肺泡灌洗液(BALF)及血清胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-10水平。采用蛋白质印迹法检测大鼠肺组织样品中胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)/PI3K/AKT信号通路组分的磷酸化状态。结果:与对照组和低剂量益气组比较,大剂量益气固表丸治疗可显著改善COPD大鼠呼吸参数,减轻肺损伤和炎症,降低BALF和血清炎症介质水平。此外,高剂量益气固表丸干预的COPD大鼠肺组织标本中磷酸化IGF-1R、p-PI3K、p-AKT、p-GSK3、p-mTOR蛋白水平显著降低。结论:益气固表丸对COPD有明显的治疗作用,可能与靶向IGF-1R/PI3K/AKT信号通路有关。

乌苏酸对人胰腺癌细胞PANC-1增殖和凋亡的影响

目的探讨乌苏酸对人胰腺癌细胞PANC-1增殖、凋亡的影响。方法以1.25,2.5,5,10,25,50μmol/L乌苏酸培养PANC-1细胞24,48,72 h,采用四氮唑盐(MTT)法测定细胞活性。实验分为对照1组(等体积二甲基亚砜)及乌苏酸低、中、高剂量组(5,10,20μmol/L乌苏酸),显微镜下观察细胞形态,采用Western blot法检测磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt),磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-m TOR),活化半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2关联X蛋白(Bax)的蛋白表达水平,采用细胞集落形成实验观察细胞增殖情况。实验分为对照2组(等体积二甲基亚砜)和乌苏酸组(10μmol/L乌苏酸),采用细胞划痕实验观察细胞培养48,72 h的迁移情况。利用分子对接实验模拟乌苏酸与PI3K和Akt2的相互作用。结果随着乌苏酸浓度的升高,PANC-1细胞活性逐渐减弱,24,48,72 h时的半数抑制浓度(IC50)分别为7.89,6.26,5.06μmol/L。与对照1组比较,乌苏酸各剂量组细胞逐渐失去原有形态,且随着浓度的增加,变形细胞数目随之增加,且细胞边界模糊不清;细胞数量显著减少(P<0.05);乌苏酸各剂量组细胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白的表达水平均显著升高,乌苏酸中、高剂量组细胞Bcl-2蛋白表达水平显著降低,乌苏酸各剂量组细胞p-m TOR,中、高剂量组细胞p-Akt,高剂量组细胞PI3K蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。与对照2组比较,乌苏酸组细胞48 h,72 h的迁移距离缩短。乌苏酸的乌苏烷型三萜类结构可进入PI3K与Akt2中的三磷酸腺苷(ATP)结合位点竞争性结合疏水口袋,从而影响PI3K和Akt2与ATP的结合,抑制其激活。结论乌苏酸可通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路的激活而抑制PANC-1细胞的增殖,促进其凋亡。