内皮素1受体拮抗剂通过调控PI3K-Akt-HIF-1α信号通路减轻兔单肺通气时肺损伤的研究

目的 探讨调控磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶-缺氧诱导因子1α(phosphatidylinositol 3-kinase-serine threonine protein kinase-hypoxia inducible factor 1 alpha,PI3K-Akt-HIF-1α)信号通路对减轻内皮素1受体拮抗剂BQ-123预处理的兔单肺通气(one-lung ventilation,OLV)时肺损伤的作用。方法 20只健康日本大耳白兔,雌雄不限,随机分为对照组、OLV组、OLV+BQ-123组和OLV+BQ-123+LY294002组,每组5只。对照组兔持续双肺通气2.5 h,OLV组、OLV+BQ-123组及OLV+BQ-123+LY294002组先行右侧OLV 2 h,再恢复双肺通气0.5 h。OLV+BQ-123组和OLV+BQ-123+LY294002组兔在OLV前10 min经股静脉注射BQ-123 50μg/kg,OLV+BQ-123+LY294002组在给予BQ-123前静脉输注磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)的特异性抑制剂(LY294002) 0.3 mg/kg,输注时间为5 min。实验结束后留取左侧肺组织,称重计算湿/干比(wet-to-dry,W/D),行病理学切片并评估肺损伤程度;采用Western blot测定PI3K-Akt-HIF-1α信号通路关键因子磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(phosphorylated serine-threonine protein kinase,p-Akt)及缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)蛋白表达。结果 与对照组比较,OLV组兔肺水肿状态、W/D、肺损伤病理评分增加,p-Akt和HIF-1α蛋白相对表达量下调(P均<0.05);BQ-123预处理干预后,OLV+BQ-123组兔肺损伤程度、W/D下降、p-Akt和HIF-1α蛋白相对表达量上调(P均<0.05),且较OLV+BQ-123+LY294002组兔肺损伤程度、W/D降低、p-Akt和HIF-1α蛋白相对表达量上调(P均<0.05)。结论 内皮素1受体拮抗剂BQ-123通过调控PI3K-Akt-HIF-1α信号通路可减轻兔OLV时非通气侧的肺损伤。

蓝萼甲素调节Akt/Nrf2/HO-1信号通路对冠心病大鼠的影响

目的:探讨蓝萼甲素(GLA)调节蛋白激酶B(Akt)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)信号通路对冠心病(CHD)大鼠的影响。方法:通过高脂饲料喂养及腹腔注射垂体后叶素制备CHD大鼠模型,设置分组为CHD组、GLA低剂量(GLA-L,5 mg/kg)组、GLA中剂量(GLA-M,10 mg/kg)组、GLA高剂量(GLA-H,20 mg/kg)组、GLA-H+LY294002(Akt/Nrf2/HO-1通路抑制剂,20 mg/kg GLA-H+40 mg/kg LY294002)组,同时以基础饲料喂养及腹腔注射生理盐水的10只大鼠为对照组;干预结束后,分别检测各组大鼠血清中血脂代谢水平[低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)以及三酰甘油(TG)]、血管内皮功能指标[内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)]、炎症因子水平(IL-6、TNF-α)、心脏组织中氧化应激水平[丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)]以及病理学及斑块面积变化、Akt/Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达水平。结果:与对照组相比,CHD组NO、T-AOC含量、PI3K、p-Akt/Akt、Nrf2、HO-1表达显著降低,ET-1、MDA、TNF-α、IL-6、TG、TC、LDL-C含量显著增加(P<0.05);与CHD组相比,GLA-L组、GLA-M组、GLA-H组NO、T-AOC含量、PI3K、p-Akt/Akt、Nrf2、HO-1表达显著增加,ET-1、MDA、TNF-α、IL-6、TG、TC、LDL-C含量显著降低(P<0.05);与GLA-H组相比,GLA-H+LY294002组NO、T-AOC含量、PI3K、p-Akt/Akt、Nrf2、HO-1表达显著降低,ET-1、MDA、TNF-α、IL-6、TG、TC、LDL-C含量显著增加(P<0.05)。结论:GLA可以通过激活Akt/Nrf2/HO-1信号通路抑制炎症反应及氧化应激水平,改善CHD大鼠病理损伤及内皮功能障碍。

乌苏酸对人胰腺癌细胞PANC-1增殖和凋亡的影响

目的探讨乌苏酸对人胰腺癌细胞PANC-1增殖、凋亡的影响。方法以1.25,2.5,5,10,25,50μmol/L乌苏酸培养PANC-1细胞24,48,72 h,采用四氮唑盐(MTT)法测定细胞活性。实验分为对照1组(等体积二甲基亚砜)及乌苏酸低、中、高剂量组(5,10,20μmol/L乌苏酸),显微镜下观察细胞形态,采用Western blot法检测磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt),磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-m TOR),活化半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2关联X蛋白(Bax)的蛋白表达水平,采用细胞集落形成实验观察细胞增殖情况。实验分为对照2组(等体积二甲基亚砜)和乌苏酸组(10μmol/L乌苏酸),采用细胞划痕实验观察细胞培养48,72 h的迁移情况。利用分子对接实验模拟乌苏酸与PI3K和Akt2的相互作用。结果随着乌苏酸浓度的升高,PANC-1细胞活性逐渐减弱,24,48,72 h时的半数抑制浓度(IC50)分别为7.89,6.26,5.06μmol/L。与对照1组比较,乌苏酸各剂量组细胞逐渐失去原有形态,且随着浓度的增加,变形细胞数目随之增加,且细胞边界模糊不清;细胞数量显著减少(P<0.05);乌苏酸各剂量组细胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白的表达水平均显著升高,乌苏酸中、高剂量组细胞Bcl-2蛋白表达水平显著降低,乌苏酸各剂量组细胞p-m TOR,中、高剂量组细胞p-Akt,高剂量组细胞PI3K蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。与对照2组比较,乌苏酸组细胞48 h,72 h的迁移距离缩短。乌苏酸的乌苏烷型三萜类结构可进入PI3K与Akt2中的三磷酸腺苷(ATP)结合位点竞争性结合疏水口袋,从而影响PI3K和Akt2与ATP的结合,抑制其激活。结论乌苏酸可通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路的激活而抑制PANC-1细胞的增殖,促进其凋亡。

LncRNA UCA-1对肾细胞癌OS-RC-2细胞增殖、凋亡的影响及机制

目的研究尿路上皮癌相关基因1(UCA-1)对肾细胞癌OS-RC-2细胞恶性生物学进程的影响。方法通过实时荧光定量PCR方法分析肾细胞癌组织与癌旁组织中UCA-1的表达;将肾细胞癌OS-RC-2细胞随机设置为3个实验组:siRNA NC组、siRNA UCA-1组与LY294002组。采用MTT实验方法分析OS-RC-2细胞的增殖速度;采用Transwell实验方法分析OS-RC-2细胞的侵袭数量;采用流式细胞术检测OS-RC-2细胞的凋亡情况;采用蛋白免疫印迹方法分析PI3K/AKT通路相关蛋白的表达。结果与肾细胞癌旁的组织比较,肾细胞癌组织的UCA-1表达上调。与siRNA NC组比较,siRNA UCA-1组以及LY294002组的OS-RC-2细胞增殖能力下降(P<0.05);OS-RC-2细胞侵袭数量下降(P<0.05);OS-RC-2细胞凋亡率增加(P<0.05);OS-RC-2细胞PI3K、AKT蛋白表达下调(P<0.05)。结论UCA-1在肾细胞癌细胞中表达增加,抑制UCA-1表达后,OS-RC-2细胞的增殖速度与侵袭数量降低,凋亡率增加,该机制与UCA-1调节PI3K/AKT信号通路相关。

藤黄健骨胶囊对膝骨关节炎鼠骨代谢指标及PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信号通路的影响

目的 探讨藤黄健骨胶囊对膝骨关节炎鼠骨代谢指标及PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信号通路的影响。方法 采用木瓜蛋白酶构建膝骨关节炎大鼠(KOA)模型,将造模成功的40只大鼠按随机数字表法分为模型组、阳性药物组、低剂量组和高剂量组,每组各10只。未造模的10只大鼠作为对照组。建模4周后,阳性药物组、低剂量组和高剂量组分别以美洛昔康水溶液、0.09 g/kg以及0.36 g/kg藤黄健骨胶囊干预,模型组和对照组以等量生理盐水灌胃,1次/d。给药4周后,观察比较各组大鼠Mankin评分及关节肿胀程度,酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测白介素-1β(Interleukin 1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、金属基质蛋白酶3(Metallomatrix proteinase 3,MMP3)、组织金属蛋白酶抑制因子-1(Tissue metalloproteinase inhibitor 1,TIMP-1)、骨钙素(Bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins,BGP)、抗洒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRACP)、I型胶原C端肽(Type I collagen carboxy-terminal peptide,CTX),Western blot法检测软骨组织PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达情况。结果 HE染色结果显示,对照组大鼠关节面、关节软骨和软骨细胞均正常;而模型组关节面呈不规则,关节软骨含少量软骨细胞或软骨细胞坏死,且关节软骨被纤维组织取代阳性药物组和高剂量组关节表面不规则,软骨细胞数量减少,而低剂量组显示软骨细胞中度坏死。与对照组比较,模型组Mankin评分、关节肿胀程度均升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,阳性药物组、高剂量组、低剂量组Mankin评分、关节肿胀程度均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);且各药物组Mankin评分及关节肿胀程度比较,阳性药物组<高剂量组<低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组IL-1β、TNF-α、MMP-3、TIMP-1水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,阳性药物组、高剂量组、低剂量组IL-1β、TNF-α、MMP-3、TIMP-1水平均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);且各药物组IL-1β、TNF-α、MMP-3、TIMP-1水平比较,阳性药物组<高剂量组<低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组,模型组TRACP、CTX水平均升高,BGP水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,阳性药物组、高剂量组、低剂量组TRACP、CTX水平明显降低,BGP水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);且各药物组TRACP、CTX水平比较,阳性药物组<高剂量组<低剂量组,BGP水平比较,阳性药物组>高剂量组>低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组PI3K、Akt、Nrf2、HO-1蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,阳性药物组、高剂量组、低剂量组PI3K、Akt、Nrf2、HO-1蛋白水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);且各药物组PI3K、Akt、Nrf2、HO-1蛋白水平比较,阳性药物组>高剂量组>低剂量组,差异有统计学意(P<0.05)。结论 藤黄健骨胶囊可显著改善膝骨关节炎鼠骨代谢水平,缓解膝骨关节炎症状,其可能机制与激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信号通路有关。

金合欢素调节IRS-1/PI3K/AKT信号通路对糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响

目的探讨金合欢素调节胰岛素受体底物-1(IRS-1)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路对糖尿病大鼠胰岛素抵抗(IR)的影响。方法选取6周龄,体质量220~235 g的SPF级SD雄性大鼠60只作为研究对象。随机选出12只大鼠作为对照组(NC组),其余48只大鼠构建2型糖尿病(T2DM)大鼠模型,造模成功后随机分为糖尿病组、金合欢素组、MG53组、金合欢素+MG53组,每组12只。检测所有大鼠空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三脂(TG)水平。采用酶联免疫吸附试验检测空腹胰岛素(FINS)水平以及胰腺组织白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,计算胰岛素敏感指数(ISI)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);计算口服葡萄糖耐量实验曲线下面积(AUC);采用苏木精和伊红(HE)染色检测胰腺组织病理变化;采用Western blot法检测IRS-1/PI3K/AKT通路蛋白表达水平。结果与NC组相比,糖尿病组大鼠体质量、FBG、TC、TG、LDL水平均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与糖尿病组相比,金合欢素组大鼠体质量、FBG、TC、TG、LDL水平均明显下降,而MG53组均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与金合欢素组相比,金合欢素+MG53组大鼠体质量、FBG、TC、TG、LDL水平均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与NC组相比,糖尿病组FBG、FINS、HOMA-IR水平均明显升高,AUC明显增大,ISI水平明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05);与糖尿病组相比,金合欢素组FINS、HOMA-IR水平均明显下降,AUC明显减小,ISI水平明显升高,而MG53组FINS、HOMA-IR水平均明显升高,AUC明显增大,ISI水平明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05);与金合欢素组相比,金合欢素+MG53组FINS、HOMA-IR水平均明显升高,AUC明显增大,ISI水平明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。与NC组相比,糖尿病组TNF-α、IL-1β水平均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与糖尿病组相比,金合欢素组TNF-α、IL-1β水平均明显下降,而MG53组TNF-α、IL-1β水平均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与金合欢素组相比,金合欢素+MG53组TNF-α、IL-1β水平均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。HE染色结果显示,NC组大鼠胰腺组织染色清晰,结构正常,可以观察到明显的外分泌腺泡和胰岛、小叶内导管和小叶间导管;与NC组相比,糖尿病组观察到血管充血、腺泡和小叶内导管聚集有炎症细胞;与糖尿病组相比,金合欢素组炎症细胞浸润现象减少,而MG53组小叶内和小叶间导管中观察到重度炎症细胞聚集;金合欢素+MG53组胰腺结构与糖尿病组相似。与NC组相比,糖尿病组p-IRS-1/IRS-1、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白水平均明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05);与糖尿病组相比,金合欢素组p-IRS-1/IRS-1、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白水平均明显升高,而MG53组p-IRS-1/IRS-1、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白水平均明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05);与金合欢素组相比,金合欢素+MG53组p-IRS-1/IRS-1、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白水平均明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论金合欢素可能通过上调IRS-1/PI3K/AKT信号通路发挥减轻糖尿病大鼠IR的作用。

高糖环境中程序性细胞死亡受体1抑制大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:程序性细胞死亡受体1(programmed death receptor-1,PD-1)在高糖环境下影响骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制尚不清楚。目的:探讨高糖环境中PD-1对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其调控机制。方法:将大鼠骨髓间充质干细胞随机分为正常糖组(5.6 mmol/L)、高糖组(30 mmol/L)、PD-1过表达组、PD-1过表达空载组、PD-1敲低组、PD-1敲低空载组、PI3K/AKT通路抑制剂组(PD-1敲低+5μmol/L LY294002)。通过在高糖培养基中培养大鼠骨髓间充质干细胞来模拟体外糖尿病环境,采用qRT-PCR检测大鼠骨髓间充质干细胞中PD-1及其配体PD-L1和成骨标志物Runx2、OSX的mRNA表达,采用碱性磷酸酶染色和茜素红S染色观察成骨分化能力,采用CCK-8检测细胞增殖情况,采用Western blot检测PD-1、PD-L1、p-PI3K、p-AKT的蛋白表达。结果与结论:①高糖组PD-1及PD-L1表达显著高于正常糖组,高糖组骨髓间充质干细胞的成骨分化能力较正常糖组显著下降;②敲低PD-1表达可以促进骨髓间充质干细胞的成骨分化、增加细胞增殖活性,同时激活PI3K/AKT通路;③加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002后,骨髓间充质干细胞成骨分化能力显著下降。结果表明:PD-1依赖于PI3K/AKT信号通路抑制高糖环境下大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。

偏痛汤1号对痛敏性偏头痛大鼠BDNF/p-Akt信号途径的影响

目的基于BDNF/p-Akt信号途径研究偏痛汤1号对硝酸甘油(NTG)致偏头痛模型大鼠作用机制的影响。方法采用随机数字表法将40只SD雄性大鼠分为空白组、假手术组、模型组、阳性药组、偏痛汤1号组,每组8只。空白组予正常饮食水饲养,假手术组予颈背部皮下注射生理盐水,其余各组大鼠予颈背部皮下注射NTG。成模后给药1周,同时检测行为学及痛阈值变化。采用ELSIA技术检测外周血浆中白细胞介素-6(IL-6)、脑神经营养因子(BDNF)、一氧化氮(NO)水平。RT-qPCR技术检测大鼠三叉神经节中降钙素基因相关肽(CGRP)、BDNF、蛋白激酶B(Akt)、Bcl-2相关死亡启动因子(BAD)及NO mRNA转录水平。Western blotting技术测定大鼠三叉神经节中BDNF、Akt及p-Akt蛋白表达。结果与模型组比较,偏痛汤1号组大鼠眼眶痛阈上调(P<0.05);血浆BDNF、NO蛋白表达水平下调(P<0.05),IL-6无显著下降趋势(P>0.05);三叉神经节中CGRP、Akt、BDNF mRNA转录水平下调(P<0.05),BAD、NO mRNA转录水平有下调趋势,但无显著差异(P>0.05),Akt、p-Akt与BDNF蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.001)。结论偏痛汤1号抑制痛敏性偏头痛的机制与调控BDNF/p-Akt信号途径,下调偏头痛相关因子CGRP、NO、IL-6等表达水平,从而减少突触递质引起的通路活化相关。

下调Ppp1r17对小鼠饮酒相关行为及AKT/GSK-3β/CREB信号通路磷酸化的影响

目的:观察下调蛋白磷酸酶1调节因子亚基17(Ppp1r17)对小鼠饮酒相关行为的作用,并分析其对蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)/糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)/cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)通路磷酸化的影响。方法:取40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组(n=10):control组;shPpp1r17①组;shPpp1r17②组和shPpp1r17③组。给予AAV-shPpp1r173周后检测其在海马组织中的mRNA和蛋白表达水平。取20只雄性C57BL/6J小鼠随机分为control组和shPpp1r17组(n=10)。注射AAV-shPpp1r173周后进行旷场实验、条件性位置偏好实验和翻正反射实验,并检测AAV-shPpp1r17定位及蛋白表达情况。取20只雄性C57BL/6J小鼠分为4组(n=5):shNC+Water组、shNC+EtOH组、shPpp1r17+Water组和shPpp1r17+EtOH组,其中EtOH组小鼠稳定自主饮用9%酒精30 d。Western blot检测Ppp1r17、p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β、p-CREB和CREB蛋白表达情况。结果:(1)实时荧光定量PCR结果显示下调序列shPpp1r17①为最佳Ppp1r17下调序列。(2)行为学结果显示,shPpp1r17组小鼠以增强运动能力和减少焦虑样情绪为特征,Ppp1r17下调可以增加饮酒CPP分数,并降低小鼠对酒精的敏感性。(3)免疫荧光结果显示,shPpp1r17可以在海马脑区特异性表达。(4)Western blot结果显示,在慢性酒精暴露后,Ppp1r17蛋白表达、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β和p-CREB/CREB的比值均显著增加。而在海马敲减Ppp1r17后,Ppp1r17蛋白表达显著降低,并且增强AKT/GSK-3β/CREB通路的活性。结论:Ppp1r17下调后可以增强酒精对小鼠的奖赏效应、增强小鼠的运动能力并降低小鼠对酒精的敏感性,其机制可能与激活AKT/GSK-3β/CREB信号通路有关。

LncRNA TUG1靶向AKT/mTOR信号通路促进卵巢癌细胞增殖和转移的研究

目的探究长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(lncRNA TUG1)通过介导蛋白激酶B/磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AKT/mTOR)信号通路对卵巢癌细胞增殖和转移的影响及可能机制。方法收集112例行卵巢癌根治术患者的卵巢癌组织及癌旁组织,采用RT-PCR检测两组织、卵巢癌细胞(OC3,SKOV3,A2780,HO-8910)及人正常卵巢上皮细胞IOSE80中TUG1表达。选择SKOV3细胞并分为si-TUG1组(转染TUG1 shRNA)和NC组(转染空载体质粒),采用CCK8、流式细胞术、划痕实验检测2组细胞增殖水平、细胞周期及细胞转移能力,Western blot检测2组蛋白激酶B(AKT)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-AKT、p-mTOR、细胞周期相关蛋白(Cyclin D1,Cyclin B1,CDK6)、转移相关蛋白(MMP-2,Snail)的相对表达量。结果RT-PCR检测结果显示,卵巢癌组织中TUG1表达高于癌旁组织(P<0.05),卵巢癌细胞OC3,SKOV3,A2780,HO-8910中TUG1表达均高于IOSE80细胞,且SKOV3中TUG1表达最高(P<0.05)。si-TUG1组细胞增殖水平、G_(2)/M期比例、细胞迁移距离均低于NC组,细胞G_(0)/G_(1)期比例高于NC组(P<0.05);si-TUG1组p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、Cyclin D1、Cyclin B1、CDK6、MMP-2,Snail蛋白表达低于NC组(P<0.05)。结论下调lncRNA TUG1表达能降低卵巢癌细胞增殖、转移能力,这可能与其能抑制AKT/mTOR信号通路有关。

DCLK1在胃癌干细胞中的作用及机制研究

目的:研究双皮质素样激酶1(doublecortin-like kinase 1,DCLK1)对胃癌干细胞生物学特性的作用,初步探讨其可能的作用机制。方法:无血清培养液悬浮培养胃癌干细胞,用DCLK1抑制剂DCLK1-IN-1靶向抑制胃癌干细胞中DCLK1活性。用Western blot法检测胃癌干细胞中DCLK1、干性相关蛋白(SOX2和OCT4)、细胞增殖相关蛋白(cyclin D1和c-MYC)、耐药相关蛋白(ABCG2和TOP2A)、上皮-间充质转化相关蛋白(E-cadherin、vimen‐tin和Snail)和PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平。用CCK-8法测定DCLK1对胃癌干细胞活力及耐药的影响;用甲基纤维素成球法测定DCLK1对胃癌干细胞自我更新的影响。用细胞划痕实验和Transwell实验测定DCLK1对胃癌干细胞迁移和侵袭功能的影响。结果:胃癌干细胞中DCLK1及干性相关蛋白SOX2和OCT4表达明显高于亲本细胞(P<0.01)。DCLK1抑制组胃癌干细胞的增殖、耐药、迁移和侵袭能力明显低于Sphere细胞组(P<0.01)。DCLK1抑制组细胞增殖相关蛋白c-MYC和cyclin D1表达下调,耐药相关蛋白TOP2A和ABCG2表达下调,上皮标志物E-cadherin表达上调,间充质标志物vimentin和Snail表达下调,PI3K/AKT/mTOR相关蛋白表达及其磷酸化水平降低(P<0.01)。结论:DCLK1在胃癌干细胞中高表达,它可能通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路促进胃癌干细胞增殖、耐药、侵袭和迁移。DCLK1可作为靶向胃癌干细胞的潜在靶点。

瓜蒌皮总皂苷调节PI3K/Akt/SIRT1信号通路减轻慢性阻塞性肺疾病大鼠的气道炎症

目的探讨瓜蒌皮总皂苷通过调节PI3K/Akt/SIRT1信号通路对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠气道炎症的影响。方法SD大鼠按照随机数字表法随机分成5组:对照组、模型组、瓜蒌皮总皂苷(300 mg/kg)组、LY294002(PI3K抑制剂,0.3 mg/kg)组、瓜蒌皮总皂苷(300 mg/kg)+LY294002(0.3 mg/kg)组,每组12只。除对照组外,其他组大鼠均构建COPD大鼠模型并给予药物干预。药物干预24 h后,检测5组大鼠肺功能;采用Giemsa染色进行肺泡灌洗液(BALF)中白细胞分类计数;HE染色观察5组大鼠肺组织病理形态变化,评测其损伤情况;试剂盒检测5组大鼠BALF上清液和血清中IL-18、IL-17水平;免疫印迹法检测各组大鼠肺组织中PI3K/Akt/SIRT1信号通路蛋白表达。结果与对照组大鼠的MV、PEF、Ri、白细胞数量、BALF上清液和血清中IL-18和IL-17水平、肺组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及SIRT1蛋白相对表达水平相比,模型组大鼠肺组织出现明显病理损伤,Ri、白细胞数量、BALF上清液和血清中IL-18和IL-17水平显著升高(P<0.05),MV、PEF、肺组织p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt及SIRT1蛋白相对表达显著降低(P<0.05)。与模型组和瓜蒌皮总皂苷+LY294002组大鼠的MV、PEF、Ri、白细胞数量、BALF上清液和血清中IL-18和IL-17水平、肺组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及SIRT1蛋白相对表达水平相比,瓜蒌皮总皂苷组大鼠肺组织病理损伤症状均减轻,Ri、白细胞数量、BALF上清液和血清中IL-18和IL-17水平均降低(P<0.05),MV、PEF、肺组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及SIRT1蛋白相对表达均升高(P<0.05);LY294002组大鼠肺组织病理损伤症状均加重,Ri、白细胞数量、BALF上清液和血清中IL-18和IL-17水平均升高(P<0.05),MV、PEF、肺组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及SIRT1蛋白蛋白相对表达均降低(P<0.05)。结论瓜蒌皮总皂苷可能通过激活PI3K/Akt/SIRT1信号通路,减轻COPD大鼠气道炎症,改善肺组织损伤,修复肺功能。

DCLK1激活FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路促进A549细胞的恶性行为

目的探讨双肾上腺素皮质样激酶1(DCLK1)对A549细胞增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响,并探究可能涉及的相关分子机制。方法慢病毒感染法建立稳定表达DCLK1分子的A549细胞系,反转录-聚合酶链技术和蛋白质印记法进行鉴定。CCK-8与平板克隆实验检测过表达DCLK1后细胞增殖能力变化。Transwell实验观察过表达DCLK1对细胞迁移与侵袭能力的影响。癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析DCLK1对肺腺癌细胞的调控富集通路,蛋白质印记法进行验证。结果DCLK1在A549细胞中过表达可增加细胞的增殖、迁移与侵袭等能力,而抑制FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路可削弱DCLK1对A549细胞的恶性调控。结论DCLK1通过激活FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进A549细胞的恶性生物学行为。

组胺H 1受体激动剂通过Akt/NF-κB通路抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞炎症反应

目的探讨组胺H 1受体(histamine H 1 receptor,H 1R)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的星形胶质细胞炎症反应的影响及其调控机制。方法采用LPS建立体外星形胶质细胞炎症模型,随机将大鼠原代星形胶质细胞分为对照组、LPS组、LPS+H 1R激动剂组(2-pyridylethlamine,Pyri)和H 1R激动剂组。对照组仅加入培养液,LPS+H 1R激动剂组提前在培养液中加入100μmol·L-1的Pyri,1 h后再加入终浓度为100μg·L-1的LPS。CCK-8法检测细胞活性;免疫荧光法检测活化标记物GFAP和H 1R的表达;倒置相差显微镜下观察星形胶质细胞的形态变化;ELISA法检测细胞上清中炎症因子TNF-α和IL-6水平;Western blot检测p-Akt、Akt、p-NF-κB p65、NF-κB p65的蛋白表达。结果与对照组比较,LPS组星形胶质细胞分支和辐射状突起减少,GFAP表达增加,细胞表面H 1R表达下调,上清液中TNF-α和IL-6含量增加,Akt和NF-κB p65的磷酸化水平明显增加;与LPS组相比,LPS+H 1R激动剂组激活态星形胶质细胞减少,GFAP表达降低,培养基上清中TNF-α和IL-6的含量明显下降,Akt和NF-κB p65的磷酸化表达明显降低。结论H 1R激动剂能够抑制LPS诱导的星形胶质细胞活化和炎症因子的表达,且Akt/NF-κB通路可能是H 1R参与星形胶质细胞免疫调节的重要途径。

无缺口同系物1调控PI3K/AKT通路对鼻咽癌细胞迁移与侵袭能力的影响

目的:探究无缺口同系物1(NLE1)通过PI3K/AKT通路对鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的影响。方法:将鼻咽癌细胞HK-1细胞与C666-1细胞分别转染sh-NC和sh-NLE1,分为NC(空白对照)组和sh-NLE1组;免疫印迹检测HK-1细胞和C666-1细胞中NLE1、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)的蛋白表达水平。用Transwell法与细胞划痕实验检测HK-1细胞和C666-1细胞的迁移与侵袭能力。裸鼠荷瘤实验检测肿瘤的生长情况。结果:与NC组比较,sh-NLE1组HK-1细胞和C666-1细胞中NLE1、PI3K、AKT、MMP2和MMP9蛋白表达水平显著降低。与NC组比较,sh-NLE1组HK-1细胞和C666-1细胞的迁移与侵袭能力显著降低。与NC组比较,sh-NLE1组HK-1细胞和C666-1细胞的成瘤体积显著降低。结论:抑制鼻咽癌细胞NLE1的表达,可介导PI3K/AKT通路影响鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力,进而抑制鼻咽癌的生长与发展。

地奥心血康激活IRS-1/PI3K/Akt信号通路改善非酒精性脂肪性肝炎小鼠胰岛素抵抗的实验研究

目的:研究地奥心血康(DXXK)对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠胰岛素抵抗的影响及作用机制。方法:C57BL/6J小鼠随机分为正常组和造模组,造模组高脂饲料饲喂16周后随机分为模型组、吡格列酮组(6.0 mg·kg^(-1)·d^(-1)),DXXK高、中、低(200、60、20 mg·kg^(-1)·d^(-1))剂量组,每组8只,灌胃给药连续8周。检测小鼠体质量、活动度、脂肪质量、空腹血糖(FBG)、血清胰岛素(FINS)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平及肝脏中的TC、TG含量;口服葡萄糖耐量实验(OGTT)、腹腔胰岛素耐量实验(IPITT),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、胰岛素敏感指数(ISI)、OGTT和IPITT的曲线下面积(AUC);HE染色观察肝脏病理、油红O染色观察肝脏脂质蓄积情况;Western blot法检测肝脏组织IRS-1/PI3K/Akt信号通路中相关蛋白及下游靶标甾醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)蛋白水平。结果:与模型组比较,DXXK组和吡格列酮组小鼠的体质量、脂肪质量、FBG、FINS、HOMA-IR、ISI、TC、TG、AST、ALT水平、OGTT和IPITT的AUC均显著降低(P<0.05,P<0.01),活动度显著升高,肝脏脂质沉积和肝功能异常明显改善(P<0.05,P<0.01),肝细胞脂肪变性和气球样变明显减轻,肝脏p-IRS-1/IRS-1、PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达显著上调,SREBP-1c蛋白表达显著下降(P<0.05,P<0.01)。结论:DXXK可以改善NASH小鼠的胰岛素抵抗,其作用机制可能与激活IRS-1/PI3K/Akt信号通路有关。

ESRP1联合多模态MRI对前列腺癌的诊断价值及ESRP1对病理发展的影响机制

目的探究上皮剪接调节蛋白1(ESRP1)联合多模态MRI对前列腺癌的诊断价值及ESRP1对病理发展的影响机制。方法通过多模态MRI对60例前列腺外周带病变患者(46例前列腺外周带慢性炎症患者,14例早期前列腺癌患者)的前列腺外周带病灶进行检查,通过RT-qPCR检测前列腺外周带病变组织ESRP1的mRNA水平。将PC-3细胞分为对照组、shRNA-NC组、shRNA-ESRP1组、LV-NC组和LV-ESRP1组。使用Lipofectamine 2000对细胞转染shRNA-NC、shRNAESRP1、LV-NC和LV-ESRP1。通过MTT法检测细胞增殖;通过流式细胞术检测细胞凋亡;通过Transwell检测细胞迁移和侵袭;通过RT-qPCR检测细胞中ESRP1、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP9、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的mRNA表达水平;通过Western blot检测细胞中ESRP1、p-PI3K、p-AKT和p-NF-κB p65蛋白表达水平。结果与前列腺外周带慢性炎症患者相比,早期前列腺癌患者外周带病变组织中ESRP1的mRNA水平升高(t=6.372,P<0.001)。多模态MRI联合ESRP1 mRNA诊断早期前列腺癌的曲线下面积和敏感性高于多模态MRI或ESRP1 mRNA的单独诊断。与对照组和shRNA-NC组比较,shRNA-ESRP1组ESRP1的mRNA和蛋白表达水平均降低,相对细胞活力降低,细胞凋亡率和Bax的mRNA表达水平升高,Bcl-2的mRNA表达水平降低,迁移和侵袭细胞数量降低,MMP2和MMP9的mRNA表达水平均降低,E-cadherin的mRNA表达水平升高,N-cadherin和Vimentin的mRNA表达水平降低,p-PI3K、p-AKT和p-NF-κB p65表达水平降低(P<0.05)。与对照组和LV-NC组比较,LVESRP1组ESRP1的mRNA和蛋白表达水平、相对细胞活力、迁移和侵袭细胞数量、Bcl-2、MMP2、MMP9、N-cadherin和Vimentin的mRNA水平、p-PI3K、p-AKT和p-NF-κB p65表达水平均降低(P<0.05),细胞凋亡率、Bax和E-cadherin的mRNA水平均升高(P<0.05)。与对照组和LV-NC组比较,LV-ESRP1组ESRP1的mRNA和蛋白表达水平、相对细胞活力、迁移和侵袭细胞数量、Bcl-2、MMP2、MMP9、N-cadherin和Vimentin的mRNA水平、p-PI3K、p-AKT和p-NF-κB p65表达水平均升高(P<0.05),细胞凋亡率、Bax和E-cadherin的mRNA水平均降低(P<0.05)。结论多模态MRI联合ESRP1诊断早期前列腺癌具有较高价值,ESRP1可能通过PI3K/AKT/NF-κB通路调节前列腺癌细胞的恶性行为。

丝胶通过PI3K/Akt信号通路对受损INS-1细胞糖酵解的调控作用

目的观察丝胶对链脲佐菌素(STZ)致损伤大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1细胞)PI3K/Akt信号通路和糖酵解的调控作用。方法实验以体外培养的INS-1细胞为研究对象随机分为五组,正常对照组、模型组、丝胶组、Akt1抑制剂组、Akt1激动剂组。运用蛋白印迹和实时荧光定量PCR法检测各分组细胞的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K),蛋白激酶B(Akt),磷酸果糖激酶-1(PFK1),6-磷酸果糖-2,6-二磷酸酶(PFKFB2)的蛋白及mRNA的表达情况。结果与正常对照组相比,模型组PI3K,p-Akt,PFK1,PFKFB2的蛋白表达显著下降(P<0.05);丝胶组与模型组相比PI3K,p-Akt,PFK1,PFKFB2的蛋白表达显著增高(P<0.05);Akt1抑制剂组与丝胶组相比,p-Akt,PFK1,PFKFB2的蛋白表达显著降低(P<0.05);Akt1激动剂组与丝胶组相比,p-Akt,PFK1,PFKFB2的蛋白呈现上升的趋势。各组INS-1细胞中PI3K,Akt,PFK1,PFKFB2 mRNA的变化趋势与蛋白一致。结论丝胶对STZ致损伤INS-1细胞发挥保护作用的机制可能是,靶向Akt1影响PI3K/Akt信号通路增强糖酵解。

程序性细胞死亡配体-1通过调节T细胞免疫在脊髓损伤小鼠模型中发挥神经保护作用

目的探究程序性细胞死亡配体-1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)通过调节T细胞免疫以及PI3K/Akt/mTOR信号通路在脊髓损伤(SCI)小鼠模型中发挥保护作用。方法采用C57BL/6小鼠建立SCI模型,分为假手术组(Sham)、SCI组、SCI+PD-L1抗体组(SCI+Ab)和SCI+PD-L1蛋白组(SCI+PRO)。C57BL/6小鼠和PD-L1基因敲除小鼠进行SCI造模,分为假手术组(Sham WT)、PD-L1敲除假手术组(Sham PD-L1 KO)、SCI模型组(SCI WT)、PD-L1敲除SCI模型组(SCI PD-L1 KO)。应用Western blotting和qRT-PCR检测SCI后不同时间点脊髓组织中PD-L1的表达;通过Basso小鼠运动量表(BMS)评估小鼠运动功能;利用qRT-PCR和流式细胞术分析SCI后炎症因子水平和T细胞亚群的变化;Western blotting检测PI3K/Akt/mTOR信号通路活化情况。结果小鼠经SCI造模后脊髓组织中PD-L1表达上调,于第7天达峰值。与SCI PD-L1 KO组相比,SCI WT组的小鼠在SCI后7 d、14 d和28 d时BMS评分均显著升高(P<0.05),造模后第7天炎症因子IL-1α、IL-2、IFN-γ和TNF-α水平显著降低(P<0.05);与SCI+PBS组相比,SCI+PRO组Foxp3水平显著升高,Th1和Th17细胞水平显著降低,Th2和Treg细胞水平显著升高(P<0.05);与SCI PD-L1 KO组相比,SCI WT组小鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路磷酸化程度显著升高(P<0.05);与SCI+PBS组和SCI+Ab组相比,SCI+PRO组PI3K/Akt/mTOR信号通路磷酸化程度显著降低(P<0.05)。结论PD-L1通过调节Th1、Th17、Th2和Treg细胞平衡,并抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,从而减轻SCI后的炎症反应,发挥神经保护作用。PD-L1有望成为治疗SCI的新靶点。

miR-106a通过调控PI3K/PDK1/AKT蛋白通路调节胃癌细胞生物学行为的研究

目的探讨miR-106a对胃癌细胞生物学行为的影响及其作用机制。方法选取AGS人胃癌细胞系,经培养后分为27个样本。所有样本随机分为miR-106a inhibitor、miR-mimic、miR-NC共计3组,分别给予miR-106a抑制剂、miR-106a模拟物及安慰剂干预。观察各组细胞存活率、细胞周期、细胞侵袭、迁移及caspase活性、Bax、Bcl-2、Casepase-3蛋白相对表达量、p85β、p-PDK1、p-AKT蛋白相对表达量。结果与miR-NC组比较,miR-106a inhibitor组AGS细胞活性降低[(分别为15.01±0.97)、(69.82±2.31)%](P<0.01);miR-106a mimics组AGS细胞G0/G1期细胞比例降低(P<0.05)(分别为17.33±1.04、58.24±0.82),G2/M和S期细胞比例升高(分别为50.11±1.12、35.64±1.07和31.56±0.92、9.24±0.25);miR-106a inhibitor组AGS细胞G0/G1期细胞比例升高(分别为78.43±1.12、58.24±0.82)(P<0.05),G2/M和S期细胞比例降低(分别为33.65±0.99、35.64±1.07和19.78±0.84、9.24±0.25)(P<0.01)。与miR-NC相比,miR-106a mimics组AGS细胞的迁移、侵袭能力增强,miR-106a inhibitor组AGS细胞的迁移、侵袭能力减弱(P<0.01);与miR-NC相比,miR-106a mimics组AGS细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9活性降低,miR-106a inhibitor组AGS细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9活性升高(P<0.05);miR-NC相比,miR-106a mimics组AGS细胞Bax(分别为0.69±0.07、1.48±0.15)、Casepase-3蛋白(分别为0.37±0.04、0.91±0.09)相对表达量降低,Bcl-2蛋白相对表达量升高(分别为1.53±0.12、0.94±0.09),miR-106a inhibitor组AGS细胞Bax(分别为2.07±0.21、1.48±0.15)、Casepase-3蛋白(分别为1.23±0.12、0.91±0.09)相对表达量升高,Bcl-2蛋白相对表达量降低(P<0.05)(分别为0.65±0.07、0.94±0.09);与miR-NC相比,miR-106a mimics组AGS细胞p85β(分别为1.24±0.12、0.94±0.09)、p-PDK1(分别为2.13±0.23、1.01±0.10)、p-AKT蛋白(分别为1.14±0.11、0.72±0.06)相对表达量升高,miR-106a inhibitor组AGS细胞p85β(分别为0.69±0.07、0.94±0.09)、p-PDK1(分别为0.75±0.07、1.01±0.10)、p-AKT(分别为0.53±0.05、0.72±0.06)相对表达量降低(P<0.05)。结论miRNA-106a表达能通过调控宫颈癌细胞PI3K/PDK1/AKT蛋白通路调控其细胞生物学行为,包括降低癌细胞活力、迁移和侵袭,诱导癌细胞细胞周期停滞,抑制miRNA-106a表达可能是胃癌患者治疗的新靶点之一。