遗传性铁粒幼细胞贫血致病的ALAS2基因表达载体的构建

X连锁遗传性铁粒幼细胞贫血 (XLSA)是红系特异性δ 氨基 γ酮戊酸合酶 (δ amionlevulinicacidsyntase 2 ,ALAS2 )基因突变造成的 ,本研究构建ALAS2基因的真核表达载体 ,观察表达载体转染真核细胞后蛋白表达的情况。将获自人胎肝的ALAS2基因插入到红色荧光蛋白质粒 pDs red2 N1中 ,命名为pDs red2 N1 ALAS2 ;采用电穿孔方法将质粒转染K5 6 2细胞 ;转染后 4 8小时提取细胞总RNA ,进行RT PCR检测ALAS2基因表达 ;流式细胞术检测红色荧光蛋白表达。再采用脂质体方法将质粒转染COS7细胞 ,转染后 72小时提取细胞总RNA ,RT PCR检测ALAS2基因表达 ,荧光显微镜观察COS7细胞红色荧光蛋白表达情况。结果表明 :构建了一种 pDs red2 N1 ALAS2真核表达载体 ,提取质粒DNA经酶切、电泳可以看到在 4 70 0bp和176 4bp处存在两条电泳条带 ;全长测序证实构建的载体序列正确 ;质粒转染K5 6 2和COS7细胞后均出现阳性ALAS2基因转录产物 ;流式细胞术检测转染后K5 6 2细胞红色荧光蛋白表达的阳性细胞百分率为 19.2 % ;荧光显微镜显示转染后COS7细胞红色荧光蛋白 ,表达高峰出现在转染后第 3天 ,阳性细胞百分率为 10 .7% ,并可持续表达 10天左右。红色荧光蛋白的表达可以间接说明ALAS2基因的表达。结论

遗传性铁粒幼细胞贫血研究进展及基因治疗的可能性

δ氨基γ酮戊酸合酶(ALAS)是血红蛋白合成重要的限速酶,目前发现实际有两种ALAS,真正影响血红素合成的是δ氨基γ酮戊酸合酶2(ALAS2)。X连锁铁粒幼细胞贫血(XLSA)与ALAS2的基因突变有明确的关系,近年陆续报道25种可导致XLSA的ALAS2的基因突变,其中两种是本课题组首次报道的。针对这种明确的单基因疾病有可能开展基因治疗。

铁粒幼细胞贫血家系一个新的ALAS2基因突变

目的 确定一个铁粒幼细胞贫血家系是由于ALAS2基因突变所致。方法 用聚合酶链反应扩增X染色体上与ALAS2距离小于 1.7Mb的微卫星DXS 991和DXS 1199,用变性凝胶电泳进行 3代家族成员 9人 (包括第 2代 2例患者 )的单体型分析 ;克隆患者以及正常人ALAS2基因的cDNA全部编码区 ,并测序比较。结果 该家系 2例先证者都从母亲获得同一ALAS2等位基因。健康兄、妹 2人则获得另一条ALAS2等位基因。克隆患者和正常人ALAS2cDNA编码区后测序发现 ,患者第 5外显子A5 2 3G突变 ,导致苏氨酸变为丙氨酸 ;第 3外显子T372C突变 ,导致亮氨酸由脯氨酸替代 ,后者在ALAS2可剪拼区内 ,意义尚不明确。结论 在X连锁遗传性铁粒幼细胞贫血家系新发现了一种导致发病的ALAS2基因第

X连锁性铁粒幼细胞贫血家系新发现ALAS2基因G514A突变

目的明确2例患有铁粒幼细胞贫血同胞兄弟系X连锁性铁粒幼细胞贫血,并鉴定其家系的ALAS2基因。方法利用PCR-SSCP技术分析该家系先证者,外祖父母,父母及其患病兄弟6人的ALAS2基因,确定存在基因突变,之后通过测序分析明确具体突变的位点及碱基。结果该两例患儿在ALAS2基因第5外显子都存在突变,该突变来自于母系家族,其母亲和外祖母为携带者;通过测序分析进一步明确具体的突变为ALAS2基因G514A突变,导致甲硫氨酸被异亮氨酸所替代。结论该家系患者为ALAS2基因突变所致的X连锁性铁粒幼细胞贫血,存在一种新的突变基因-ALAS2基因第5外显子G514A突变。