沼泽型水牛ALK3基因克隆分析与表达模式研究

试验旨在对沼泽型水牛ALK3基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在水牛组织中的表达规律进行系统研究。根据GenBank中已公布的牛ALK3基因序列设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增、克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法分析和预测了水牛ALK3的遗传进化及蛋白质的理化性质、二级和三级结构;并应用QRT-PCR技术对ALK3基因在水牛组织中的表达进行了差异分析。结果表明,水牛ALK3基因编码区全长1 599bp,共编码532个氨基酸。多重序列比较分析显示,水牛ALK3核苷酸序列与牛、绵羊、猪、马、人和小鼠相应序列的同源性分别为98%、96%、95%、93%、94%和91%。系统进化树分析显示,ALK3基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。对ALK3蛋白质的分析表明该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在丝氨酸/苏氨酸激酶和GS等结构。定量分析结果显示,ALK3在水牛生殖脊、心脏、肝脏、颗粒细胞、肺脏、卵丘细胞、肾脏、下丘脑、垂体、大脑等15种组织或细胞中有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,垂体、肺脏和睾丸次之,卵丘细胞表达量最低。本研究成功克隆了沼泽型水牛ALK3基因,并研究了其在不同水牛组织细胞中的表达规律,为阐明其在水牛繁殖过程中的功能及转基因载体构建中的应用研究奠定了理论基础。

ALK3基因敲除小鼠的繁育及基因鉴定

为了繁育和鉴定ALK3基因敲除小鼠，将引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖，繁殖成功后提取每种基因型小鼠组织基因组DNA，用PCR法进行鉴定，将其雄性杂合子与雌性杂合子交配。结果表明：ALK3杂合子小鼠的繁殖和饲养均获得成功，亦获得了较多的基因敲除纯合子小鼠。说明正确的饲养繁殖以及鉴定方法是从杂合子中获得ALK3基因敲除纯合子小鼠的有效途径。

ALK3／α-MHC基因敲除小鼠部分生物学特性的观测

目的测定ALK3／α-MHC和C57BL／6小鼠的生理生化正常值及其脏器重量等。方法采用全自动生化分析仪及血细胞分析仪分别8～9周龄C57BL／6、ALK3雌、雄小鼠的常用血液学指标及生化指标值进行检测：并测定了各小鼠的脏器。结果C57BL／6和ALK3／α-MHC小鼠血液的PIT、HGB差异显著（P〈0．05）。C57BL／6和ALK3／α-MHC雌、雄之间小鼠丙氨酸转氨酶（ALT）、肌酸激酶（CK）差异显著；乳酸脱氢酶（LDH）差异极显著。脏器系数无显著差异。结论ALK3／α-MHC血常规、血清生化指标和脏器指标的测定数据，将为从事生物医药研究等的科研人员提供参考。

Alk3信号途径与心脏发育

骨形态形成蛋白受体IA(Receptor IA of bone morphogenetic protein,BMPR1 A)又名 ALK3。近年来,通过大量的实验方法包括基因敲除和转基因方法发现ALK3及其信号途径在心肌细胞分化和心脏发育过程中扮演重要的角色。本文就近年来研究发现ALK3信号传递途径与心脏发育的关系作一简要综述。

ALK3在骨研究中的新进展

由成骨钙化与破骨吸收精密协调进行的骨改建确保了生理情况下骨骼发育、代谢的稳态平衡。骨形态发生蛋白受体1A(activin receptor-like kinase 3,ALK3)是骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)因子作用于细胞膜上的一个关键受体,是BMP信号流入细胞内发挥生物学效应的重要“门户”。BMP信号对骨改建作用已得到广泛研究,而近年来依托转基因小鼠模型,围绕ALK3靶点对骨改建、软骨与关节发育以及相关疾病发生与治疗的研究有了诸多新发现,拓宽了固有认知,也对现有BMP的临床应用提出了新的挑战。为此,本文汇总近年来ALK3对骨形成及骨吸收的研究,分析其在骨调控方面的作用机制,总结了ALK3在软骨及颞下颌关节发育中的重要作用,同时跟进了ALK3在临床前研究的治疗新进展,以期为后续研究和临床应用提供参考。

肺腺癌中Ventana ALK(D5F3)免疫组化检测结果的影响因素及对策

2019年《中国非小细胞肺癌ALK检测临床实践专家共识》指出,Ventana ALK(D5F3)IHC、荧光原位杂交、荧光定量PCR、NGS均可用于ALK基因融合检测。共识对ALK检测强烈推荐优先应用Ventana ALK(D5F3)IHC进行检测[1]。2020年NCCN v6指南更新推荐:Ventana-D5F3 IHC[Ventana ALK(D5F3)]伴随诊断作为独立ALK检测,无需FISH复核,可直接指导用药。

ALK(1A4)在ALK融合非小细胞肺癌诊断中的应用

目的 探讨ALK(1A4)在ALK融合非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中的应用价值。方法 收集NSCLC标本1 035例,采用免疫组化染色检测ALK(1A4)和ALK(D5F3)抗体的表达,分析两者的一致性。使用FISH、二代测序(next-generation sequencing, NGS)检测ALK的表达,评估两组结果ALK的灵敏度和特异度。结果 ALK融合NSCLC患者约占5.4%(56/1 035)。ALK(1A4)阳性率为7.2%(75/1 035),ALK(D5F3)阳性率为5.7%(59/1 035),两者的一致性高,Kappa值为0.874。ALK(1A4)、ALK(D5F3)抗体与FISH一致性较高,Kappa值分别为0.845、0.954;ALK(1A4)、ALK(D5F3)与NGS的一致性也较高,Kappa值分别为0.836、0.988。以FISH结果为参照,ALK(1A4)、ALK(D5F3)抗体的灵敏度分别为100%、98.2%,特异度分别为98.1%、99.6%。结论 ALK(1A4)抗体灵敏度高,特异度稍低,可用于临床ALK融合NSCLC的筛查。

冷藏对新鲜冰冻血浆诱导内皮细胞迁移的影响及其分子机制研究

探讨冷藏是否导致新鲜冰冻血浆(fresh frozen plasma,FFP)中的转化生长因子-β(transform growth factor-β,TGF-β)发生变化并降低其对内皮细胞迁移的诱导能力及其分子机制.为证实冷藏可能导致FFP中TGF-β的水平升高进而影响其功能,首先采用ELISA法分析当天解冻FFP(FFP Day 0)和解冻后4℃冷藏1～5天FFP中TGF-β含量,迁移实验及Western blot分析比较FFP(Day 0)和FFP(Day 5)处理人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,HPMECs)后的细胞迁移率及TGF-β信号通路Smad2和Smad3磷酸化,进一步采用ALK5-siRNA和ALK5特异性抑制剂阻断细胞TGF-βⅠ型受体ALK5的活性,分析下调TGF-β/Smad2/3信号传导后的内皮细胞迁移率.结果显示:随着冷藏时间的延长,FFP中TGF-β1水平逐渐增加,其增加率为244.31 ng/(L.d)(P<0.05);与FFP(Day 0)相比,FFP(Day 5)诱导内皮细胞HPMECs的TGF-β信号通路Smad2/3磷酸化显著增加(P<0.05);不管是FFP(Day 0)还是FFP(Day 5)体外均能诱导内皮细胞迁移,与FFP(Day 0)相比,FFP(Day 5)诱导细胞迁移能力显著降低(P<0.05);阻断TGF-βⅠ型受体ALK5的活性、下调Smad 3信号传导可恢复FFP(Day5)诱导细胞迁移能力.上述结果表明,FFP能显著诱导内皮细胞迁移,4℃冷藏增加FFP中TGF-β1水平并增加内皮细胞TGF-β1信号传导,进而降低FFP诱导内皮细胞迁移.提示,FFP复苏疗效的提高可能与增加内皮细胞迁移有关,冷藏导致内皮细胞迁移降低进而降低FFP复苏疗效.

心肌组织Pax-8基因的研究

目的 在心脏特异的骨形态形成蛋白受体IA(thebonemorphogeneticproteinreceptorIA ,又名ALK3 )基因敲除小鼠模型中 ,纯合子的心脏特异ALK3基因敲除的小鼠死于胚胎中期 ,同时伴有室间隔缺损。但是 ,ALK3不是心脏的特异基因。为了探索室间隔缺损的特异相关基因 ,ALK3下游基因的探讨是至关重要的。方法 使用基因芯片 (microarray)的方法筛选ALK3下游基因 ,并用定量逆转录 聚合酶链反应和原位杂交的方法确定ALK3下游基因的心脏特异性。结果 在心脏特异的ALK3基因敲除下 ,转录因子Pax 8基因的表达水平被下调 7 1倍 ,同时较特异地表达在 11 5天的胚胎心脏部位。结论 转录因子Pax 8基因是对心脏较特异的ALK3下游基因 。

益气化瘀法中药对糖尿病大鼠肉芽增生期创面TGF-β/ALK5/Smad2/3通路的影响

目的 :探讨益气化瘀法中药对糖尿病大鼠肉芽增生期创面转化生长因子-β(TGF-β)/激活素受体样激酶(ALK)5/Smad蛋白2/3通路的影响。方法 :将50只大鼠随机分为益气化瘀组、益气组、化瘀组、糖尿病对照组、正常对照组。通过腹腔注射链脲佐菌素和外科方法建立糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型,运用Westernblot技术手段分别检测各组肉芽增生期创面成纤维细胞ALK5/Smad2/3的表达水平。结果:糖尿病对照组ALK5表达水平明显高于正常对照组(P<0.05);益气化瘀组ALK5表达水平明显低于糖尿病对照组(P<0.05),其与益气组、化瘀组、正常对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。糖尿病对照组smad2表达水平明显高于正常对照组(P<0.05);益气化瘀组smad2表达水平与各组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。糖尿病对照组smad3表达水平明显高于正常对照组(P<0.05);益气化瘀组smad3表达水平低于化瘀组(P<0.05),明显低于糖尿病对照组、益气组(P<0.01),高于正常对照组(P<0.05)。结论:糖尿病创面难以愈合及瘢痕形成的机制可能与ALK5/Smad2/3通路有关,益气化瘀中药可能通过抑制ALK5/Smad2/3通路,加速创面愈合,减少瘢痕形成。