阿江榄仁酸由AMPK/mTOR/HO-1信号通路调控自噬对糖尿病视网膜病变影响

目的探讨阿江榄仁酸(arjunolic acid,AA)对糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)大鼠视网膜细胞自噬及AMPK/mTOR/HO-1信号通路的影响。方法以健康SD大鼠为研究对象,构建链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型,随机分为对照组(Con)组、模型(STZ)组、AA低剂量(AAL,10 mg/kg)组和AA高剂量(AAH,10 mg/kg)组。连续给药10周后,HE染色检测视网膜组织病理结构;qRT-PCR检测视网膜组织白介素(IL)-1β、IL-6和线粒体丙酮酸转运载体(MPC)-1的mRNA表达;二氢乙锭(DHE)染色评估视网膜组织ROS产生;Western blot检测自噬和AMPK/mTOR/HO-1信号通路相关蛋白表达。结果与Con组比较,STZ组大鼠视网膜出现肿胀和空泡样变化等病理变化,中央视网膜ONL层厚度和细胞核计数明显降低(P<0.01);IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA水平显著增高(P<0.05);视网膜外核层(ONL)、内核层(INL)和神经节细胞层(GCL)中ROS产生增加(P<0.01);LC3II/I比率、HO-1和p-AMPK/AMPK蛋白表达显著降低,p62和p-mTOR/mTOR表达升高(P<0.01)。与STZ组比较,AAL和AAH组大鼠视网膜ONL厚度和细胞核计数逐渐升高,结构相对规整(P<0.05);AAH组IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达明显降低(P<0.05);视网膜ONL、INL和GCL中ROS产生逐渐降低(P<0.01);LC3II/I比率、p-AMPK/AMPK和HO-1表达逐渐升高,p62和p-mTOR/mTOR表达逐渐降低(P<0.01)。结论阿江榄仁酸可能是治疗DR的候选药物,可能机制为通过AMPK/mTOR/HO-1调节的自噬途径保护视网膜细胞免受STZ诱导的氧化应激和炎症损伤。

青蒿琥酯调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响

目的探讨青蒿琥酯对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡和自噬的作用及其分子机制。方法体外培养人肾母细胞瘤细胞株SK-NEP-1并以0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0μmol/L浓度的青蒿琥酯处理,采用CCK-8法测定各组细胞活力并筛选出青蒿琥酯最佳作用浓度。将SK-NEP-1细胞随机分为对照组、青蒿琥酯(100.0μmol/L)组、AMPK抑制剂Dorsomorphin(10.0μmol/L)组、青蒿琥酯(100.0μmol/L)+Dorsomorphin(10.0μmol/L)组,以青蒿琥酯和Dorsomorphin单独或联合处理各组细胞后,采用CCK-8法检测各组细胞活力,采用平板克隆形成实验检测各组细胞的集落形成情况;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况;采用MDC荧光染色法检测各组细胞的自噬情况;采用蛋白免疫印迹法检测各组细胞中凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、cleaved多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]、自噬相关蛋白[轻链3(LC3)Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1]及AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白的表达情况。结果不同浓度青蒿琥酯均可抑制SK-NEP-1细胞的活力(均P<0.05),且随浓度升高其抑制作用增强。用100.0μmol/L青蒿琥酯和10.0μmol/L Dorsomorphin分别处理SK-NEP-1细胞后,与对照组相比,青蒿琥酯组细胞的凋亡率、自噬空泡相对量及Bax、cleaved PARP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达水平均升高(均P<0.05),细胞活力、集落形成率及Bcl-2、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均降低(均P<0.05);Dorsomorphin组细胞凋亡率、自噬空泡相对量及Bax、cleaved PARP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达水平均降低(均P<0.05),细胞活力、集落形成率及Bcl-2、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均升高(均P<0.05)。青蒿琥酯和Dorsomorphin联合干预SK-NEP-1细胞逆转了青蒿琥酯的抗肿瘤作用。结论青蒿琥酯可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路增强肾母细胞瘤细胞自噬,进而抑制其增殖并促进其凋亡。

ACSL4通过AMPK/mTOR通路抑制七氟醚诱导神经元铁死亡机制的实验研究

目的探讨酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-CoA syntbetase long chain family member 4,ACSL4)在七氟醚(sevoflurane,Sev)诱导的神经元细胞损伤中的作用及机制。方法以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为研究对象,分别设置对照组(二甲基亚砜,10μmol/L)、Sev组和Sev+铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1,10μmol/L)组,采用CCK-8法检测细胞活性。体外构建4.1%Sev暴露的术后认知功能障碍模型,按照转染类别分为Ctrol组、Sev组、Sev+si-NC组、Sev+si-ACSL4组和Sev+si-ACSL4+compound C组。采用比色法检测各组细胞中丙二醛(malonaldehyde,MDA)、4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和Fe2+含量;2’,7’-二氯荧光素二乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针检测活性氧水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ACSL4,谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)和溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)mRNA表达;蛋白免疫印迹法(WB)检测ACSL4,GPX4,腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)、磷酸化(phosphorylated,p)-AMPK,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin)mTOR和p-mTOR蛋白表达。结果CCK-8结果显示,Sev组细胞活力(0.41±0.11)较对照组(0.98±0.07)明显降低,Sev+Fer-1组细胞活力(0.83±0.09)较Sev组显著升高,差异具有统计学意义(t=7.572,5.118,均P<0.01)。Sev组细胞中Fe2+,MDA,4-HNE,ROS水平和p-AMPK/AMPK比率以及ACSL4的mRNA和蛋白表达高于Ctrol组(t=5.900,7.421,4.795,13.517,10.825,9.945,11.334),GSH,p-mTOR/mTOR比率以及SLC7A11,GPX4的mRNA和蛋白表达低于Ctrol组(t=20.438,3.551,11.460,12.211,6.845,8.287),差异具有统计学意义(均P<0.05)。Sev+siACSL4组Fe2+,MDA,4-HNE,ROS水平和p-AMPK/AMPK比率以及ACSL4的mRNA和蛋白表达低于Sev+siNC组(t=3.818,3.164,3.054,4.465,13.088,7.918,9.737),细胞活力、GSH含量、p-mTOR/mTOR比率以及SLC7A11,GPX4的蛋白表达高于Sev+si-NC组(t=2.912,7.248,7.574,20.092,5.915),差异具有统计学意义(均P<0.05)。Sev+si-ACSL4+compound C组细胞活力、GSH含量和SLC7A11,GPX4蛋白表达低于Sev+si-ACSL4组(t=4.435,8.521,4.522,8.767),而Fe2+,MDA,4-HNE和ROS水平高于Sev+si-ACSL4组(t=10.046,4.004,2.957,3.752),差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论抑制ACSL4表达可通过激活AMPK/mTOR信号通路减轻Sev诱导的SH-SY5Y细胞铁死亡。

基于AMPK/mTOR通路探讨注射用益气复脉对TBHP诱导H9c2细胞损伤的保护作用

目的:探讨注射用益气复脉(YQFM)通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬减轻叔丁基过氧化氢(TBHP)所致H9c2心肌细胞损伤的机制。方法:体外培养H9c2心肌细胞,分为正常对照组、TBHP组、TBHP+YQFM组。CCK-8法检测各组H9c2心肌细胞存活率;免疫荧光检测细胞自噬情况;免疫印迹法检测各组细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达。结果:用2、4、8、16 g/L的YQFM预处理后,可显著恢复TBHP诱导的H9c2细胞损伤;免疫荧光染色结果显示,与正常对照组相比,TBHP组细胞LC3荧光强度显著升高(P<0.01);与TBHP组相比,TBHP+YQFM组LC3荧光强度降低,其中2 g/L YQFM组具有显著性(P<0.05)。Western blot检测结果显示:TBHP组p-AMPK/AMPK、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达显著增加,p-mTOR/mTOR比率显著降低;YQFM预处理使自噬相关蛋白p-AMPK/AMPK、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率明显降低,4 g/L YQFM组p-mTOR/mTOR比率明显升高。结论:注射用益气复脉能有效拮抗TBHP引起的H9c2细胞损伤,其机制与通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬途径有关。

甲基莲心碱通过调节AMPK/mTOR/NLRP3信号通路减轻慢性皮肤溃疡大鼠的炎症反应

目的:探讨甲基莲心碱(Nef)调节AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)信号通路对慢性皮肤溃疡(CSU)大鼠炎症反应的影响。方法:将90只大鼠随机分为空白对照组(NC组)、CSU组、Nef组、AMPK抑制剂(Compound C)组、Nef+Compound C组,每组18只大鼠。除NC组外的其他各组大鼠通过剪开创口注射氢化可的松以及喷洒金黄色葡萄球菌构建CSU大鼠模型。造模完成后,Nef组和Compound C组分别将20%Nef、10μmol·L^(-1) Compound C与50 mL的20%高渗盐水凝胶混合敷在伤口处,Nef+Compound C组将20%Nef和10μmol·L^(-1) Compound C一起添加到20%高渗盐水凝胶中敷在伤口处,持续治疗2周,NC组、CSU组用等量盐水凝胶处理伤口。观察大鼠皮肤创面愈合情况;ELISA法检测血清白细胞介素(IL)-1β、IL-8、TNF-α水平;水解法检测创面肉芽组织中羟脯氨酸(HyP)水平;HE染色检测肉芽组织病理学变化;Western blotting检测CCL4、CCL2、CXCL12以及AMPK/mTOR/NLRP3信号通路蛋白表达水平。结果:CSU组大鼠可看到新生肉芽组织,并且有大量炎症细胞浸润现象,CSU组较NC组IL-1β、IL-8、TNF-α含量显著升高(P<0.05);与CSU组相比,Nef组创面愈合率、HyP含量、p-AMPK/AMPK蛋白水平显著增加(P<0.05),IL-1β、IL-8、TNF-α含量、CCL2、CXCL12、CCL4、mTOR、NLRP3蛋白水平显著下降(P<0.05),而Compound C组趋势相反(P<0.05);Compound C消除了Nef对CSU大鼠炎症反应的减轻作用。结论:Nef可能通过调控AMPK/mTOR/NLRP3信号通路减轻CSU大鼠炎症反应。

二甲双胍通过AMPK/mTOR通路抑制尿道纤维化的机制

尿道纤维化导致的尿道狭窄(Urethral stricture disease,USD)是指尿道管腔狭窄,同时伴有粘膜和周围海绵体组织的纤维瘢痕。主要症状是尿道狭窄导致排尿困难,随着病情的发展,后期可能出现膀胱失约、膀胱输尿管反流,甚至肾积水和肾功能损害等严重并发症。与大多数实质器官纤维化(如肺纤维化、肾纤维化)的治疗方法类似,目前仍没有药物可以完全逆转尿道纤维化。尿道狭窄的治疗仍以手术切除为主,但术后再狭窄一直是限制其疗效的瓶颈,据报道,内镜下处理的尿道狭窄复发率高92%。因此,迫切需要开发手术以外的替代策略,并尝试通过抑制尿道损伤后纤维化的进展来预防尿道狭窄。二甲双胍目前在临床上常用于II型糖尿病的治疗,近年来,越来越多的实验研究表明,二甲双胍可能在抑制纤维化等方面卓有成效,其作用在肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化等实质器官纤维化的细胞学研究中尤其显著。尽管二甲双胍治疗纤维化尚未应用于临床,但现有的实验数据表明,二甲双胍可能通过AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)通路缓解组织、细胞纤维化。AMPK是一种重要的能量敏感丝氨酸/苏氨酸激酶,参与多种分解代谢过程,如葡萄糖摄取和代谢,从而维持能量平衡。哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin,mTOR)是自噬过程中重要的调节分子。既往的研究提示,激活AMPK可通过抑制mTOR而促进自噬的发生。并且多项研究报道,在多种疾病模型中二甲双胍可显著提高AMPK磷酸化水平,使mTOR的磷酸化水平下降,进而促进自噬。本研究以尿道损伤大鼠和尿道瘢痕成纤维细胞为研究对象,观察二甲双胍对尿道纤维化的影响,探讨二甲双胍是否可以通过诱导成纤维细胞自噬发挥抗尿道纤维化的作用。

HTD4010可减轻脓毒症心肌病小鼠的心肌损伤:基于促进AMPK/mTOR信号通路介导的自噬

目的探究HTD4010对脂多糖(LPS)所致脓毒症心肌病(SCM)小鼠的作用及潜在机制。方法将45只雄性ICR小鼠随机分为3组:对照组、LPS组(10 mg/kg)和LPS+HTD4010组(LPS注射后的1 h和6 h分别皮下注射2.5 mg/kg HTD4010),15只/组。采用超声评价小鼠心功能,HE染色观察心肌组织病理变化,酶联免疫吸附试验检测小鼠血清和心肌组织中炎症因子IL-6和TNF-α的含量,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡水平,蛋白免疫印迹法检测小鼠心肌组织中凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白及AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达水平,透射电镜观察心肌线粒体超微结构。结果与对照组相比,LPS组心肌病理损伤严重,有不同程度心肌纤维断裂及排列结构的紊乱、炎性细胞的浸润和线粒体损伤,心脏LVEF、FS值显著降低(P<0.01),血清和心肌组织中IL-6和TNF-α显著升高(P<0.01),心脏组织细胞凋亡率显著升高(P<0.01),Bax、p-62、p-mTOR蛋白表达升高(P<0.05),Bcl-2、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01)。与LPS组相比,LPS+HTD4010组心肌病理损伤明显减轻,心脏LVEF、FS值显著升高(P<0.01),血清和心肌组织中IL-6和TNF-α显著降低(P<0.01),心肌组织细胞凋亡率显著减少(P<0.01),Bax、p-62、p-mTOR蛋白表达降低(P<0.01,P<0.05),Bcl-2、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01)。结论HTD4010能够减轻SCM小鼠的心肌损伤,其机制可能与通过AMPK/mTOR信号通路促进自噬有关。

基于AMPK/mTOR/ERRα信号通路探讨慈菇消脂方影响非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝细胞自噬作用机制

目的基于AMPK/mTOR/ERRα信号通路探讨慈菇消脂方对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠肝细胞自噬的调控机制。方法小鼠随机分为空白组、模型组、慈菇消脂方组和抑制剂组,每组10只。采用蛋氨酸胆碱缺乏饲料喂养构建NASH小鼠模型,造模成功后给药组予相应药物干预,连续4周。HE染色观察小鼠肝组织形态并进行非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)活动度评分,电镜观察肝细胞超微结构,免疫组化检测肝组织Beclin1、LC3、p62蛋白表达,Western blot检测肝组织p-AMPK、p-mTOR、雌激素相关受体α(ERRα)蛋白表达。结果与空白组比较,模型组小鼠肝组织出现明显脂肪变性并可见大量炎性细胞浸润,肝细胞可见大量形态较规则的单层膜脂质结构,NAFLD活动度评分升高(P<0.01),肝组织Beclin1、LC3、p-AMPK蛋白表达降低(P<0.01),p62、p-mTOR、ERRα蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组小鼠肝组织脂肪变性减少,炎性细胞浸润改善,可见少量自噬体,NAFLD活动度评分降低,肝组织Beclin1、LC3、p-AMPK蛋白表达升高(P<0.01,P<0.05),p62、p-mTOR、ERRα蛋白表达降低(P<0.01)。结论慈菇消脂方可能通过调控AMPK/mTOR/ERRα信号通路相关蛋白表达介导自噬,延缓NASH进展。

沉默TUFM通过AMPK/mTOR信号通路调控线粒体自噬对肺源性心脏病模型大鼠肺动脉高压的影响

目的探讨线粒体翻译延伸因子Tu(TUFM)通过线粒体自噬促进肺动脉高压(PAH)血管重塑的作用机制。方法2022年1月—2023年6月于辽宁省人民医院中心实验室进行实验。将36只健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为空白对照(Ctrl)组、模型(PAH)组、TUFM过表达(OE)组、OE阴性对照(OE-NC)组、短发夹RNA(Sh)敲除TUFM(Sh)组和Sh-NC阴性对照(Sh-NC)组,每组6只。除Ctrl组外,其余大鼠均一次性腹腔注射1%野百合碱(60 mg/kg)诱导心源性肺水肿PAH大鼠模型;大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)在低氧(3%O 2)条件下培养24 h模拟体内肺动脉高压微环境,分为常氧(Norm)组、低氧(Hyp)组、小干扰RNA(SiRNA)-1组、SiRNA-2组、Si-NC组、OE-NC组和OE组。右心导管插管和脉冲多普勒超声检测大鼠肺血流动力学;苏木素-伊红染色检测肺小动脉病理结构;免疫荧光共染检测TUFM组织定位;细胞计数法检测细胞增殖;透射电镜观察线粒体结构和自噬小体;蛋白免疫印迹检测TUFM、自噬、凋亡和磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白表达。结果与Ctrl组比较,PAH组大鼠TUFM蛋白表达升高,且主要与PASMC标志物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在肺小动脉内膜存在共定位,而与内皮细胞标志物CD31无共定位,肺动脉收缩压(PASP)升高,肺动脉血流加速时间(PAAT)缩短,远端肺小动脉管壁呈向心性增厚,管腔狭窄几乎堵塞,TUFM、苄氯素1重组蛋白(BECN1)、人微管相关蛋白轻链3(LC3)II/I和B淋巴细胞瘤2(Bcl2)蛋白表达升高,P62、Bcl2相关X蛋白(Bax)和凋亡酶激活因子(Apaf)蛋白表达降低(P<0.05);与PAH组比较,OE组PASP升高,PAAT缩短,肺小动脉管壁厚度升高,肺动脉TUFM、BECN1、LC3II/I和Bcl2表达升高,P62、Bax和Apaf表达降低(P<0.05);与PAH组比较,Sh组PASP降低,PAAT延长,肺小动脉管壁厚度和管腔狭窄度有所改善,TUFM、BECN1、LC3II/I和Bcl2表达降低,P62、Bax和Apaf表达升高(P<0.05)。与Norm组比较,Hyp组PASMC细胞TUFM蛋白表达升高;与Si-NC组细胞相比,SiRNA-1和SiRNA-2组P62、Bax蛋白表达升高,BECN1、LC3II/I、Bcl2、TUFM表达降低,线粒体结构完整,PASMC细胞增殖活性降低,细胞p-AMPK表达降低,p-mTOR表达升高(P<0.05);与OE-NC组比较,OE组细胞P62和Bax蛋白表达降低,BECN1、LC3II/I、Bcl2和TUFM表达升高,部分线粒体损伤崩解,嵴断裂消失,PASMC细胞增殖活性明显升高,细胞p-AMPK表达升高,p-mTOR表达降低(P<0.05)。结论沉默TUFM可通过激活AMPK/mTOR信号通路促进线粒体自噬加速PAH肺动脉平滑肌细胞凋亡。

TMSB10促进胃癌细胞增殖及糖酵解:基于激活AMPK/mTOR信号通路

目的探究胸腺素β10(thymosinβ10,TMSB10)在胃癌中的表达及促进胃癌进展的分子机制。方法收集蚌埠医学院第二附属医院70例胃癌患者病理切片,免疫组化检测TMSB10在胃腺癌中的表达,并分析其预后影响。为研究作用机制,通过转染技术、CCK8实验、EDU实验、Transwell小室实验,划痕实验,糖酵解实验,蛋白印迹实验,观察TMSB10对胃癌细胞的增殖和糖酵解的影响及机制研究。结果临床样本免疫组化显示,TMSB10在胃癌中高表达。同时,TMSB10的表达水平与肿瘤大小(P<0.05)、TNM分期(P<0.01)和远处转移具有相关性。在机制研究中,通过体外实验CCK-8、EDU实验、Transwel实验及糖酵解检测实验发现过表达TMSB10后促进胃癌细胞增殖、侵袭、迁移及糖酵解表型,反之亦然。Western blot实验结果显示过表达TMSB10可能通过上调AMPK/mTOR信号通路调节胃癌的发生。结论TMSB10通过AMPK/mTOR信号通路促进胃癌细胞增殖、侵袭、迁移及糖酵解过程。

黑茶水提物通过介导AMPK/mTOR信号通路调控自噬干预非酒精性脂肪肝的机制研究

为探讨安化黑茶水提物对高脂高糖(HFHS)饮食诱导的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)小鼠调控自噬改善脂肪变性的作用机制,将雄性C57BL/6J小鼠分为正常组、模型组、西药组(10 mg·kg^(-1))、黑茶低剂量组(0.75 g·kg^(-1))、中剂量组(1.5 g·kg^(-1))、高剂量组(3.0 g·kg^(-1))。采用HFHS饮食诱导小鼠NAFLD模型,造模的同时灌胃给药10周;试验结束后检测小鼠的肝指数、血脂、肝功能、肝脏病理指标、自噬指标及自噬相关信号通路表达水平。结果表明,与正常组相比,模型组小鼠肝指数和总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)含量显著升高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量明显降低;小鼠肝脏出现了脂肪变性的迹象,伴有大量大小不一的脂滴;微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、Bcl-2相互作用蛋白1(Beclin1)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶/腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK/AMPK)表达明显降低,隔离体蛋白1(p62)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-m TOR/m TOR)表达显著上升。与模型组相比,灌胃黑茶水提物可降低NAFLD小鼠肝指数和血清CHO、TG、LDL-C、AST、ALT水平,以及p62、p-m TOR/m TOR蛋白表达水平,升高血清HDL-C含量,以及LC3B、Beclin1、p-AMPK/AMPK蛋白表达水平;组织染色结果和透射电镜观察均表明肝脏的病理状态得到了改善。综上所述,黑茶水提物可能通过激活AMPK/m TOR信号通路调控自噬,减轻小鼠肝脏脂肪变性,从而改善NAFLD。

Klotho通过激活AMPK/mTOR信号通路缓解CCH大鼠海马神经元的铁死亡和氧化应激

目的探讨抗衰老基因Klotho对慢性脑低灌注(CCH)大鼠认知障碍的改善作用及对海马区神经元铁死亡和氧化应激的影响和潜在调控机制。方法使用双侧颈总动脉永久性闭塞术(2-VO)建立CCH大鼠,并将大鼠分为5组(每组n=10),其中包括假手术组、CCH组、重组Klotho蛋白(Klotho)+CCH组(重组Klotho蛋白海马区注射10 mg·kg·w^(-1),x4w)、生理盐水+CCH组(生理盐水海马区注射2mg·kg·w^(-1),x4w)、Klotho+阿卡地新(Acadesine,AICAR)+CCH组(Klotho蛋白10 mg·kg·w^(-1),x4w和AICAR 1.5 mg·kg·w^(-1),x4w海马区联合注射)。4 w后行Morris水迷宫实验检测各组大鼠的逃避潜伏期。随后安乐死大鼠,取海马组织。Western blot法检测海马组织中单磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化的AMPK(p-AMPK)、磷酸化的(p-mTOR)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、铁死亡抑制蛋白1(FSP1)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白Tau、神经元特异核蛋白(NeuN)的表达水平。ELISA试剂盒检测海马组织中的活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量。结果与假手术组比,CCH组的逃避潜伏期延长(P<0.05),p-AMPK、MDA、NSE、Tau、ROS的水平显著增加(^(均)P<0.05),但p-mTOR、SOD、GSH、GPX4、NeuN、FSP1的水平显著下调(^(均)P<0.05)。与CCH组比,生理盐水+CCH组的逃避潜伏期以及海马区p-AMPK、p-mTOR、MDA、ROS、SOD、GSH、GPX4、NSE、Tau、NeuN、FSP1的水平差异均无统计学意义(^(均)P>0.05)。与CCH组或生理盐水+CCH组比,Klotho+CCH组的逃避潜伏期缩短(^(均)P<0.05),p-AMPK、MDA、ROS、NSE、Tau的水平显著下调(均P<0.05),但p-mTOR、SOD、GSH、GPX4、NeuN、FSP1的水平显著上调(均P<0.05)。与Klotho+CCH组比,Klotho+AICAR+CCH组的逃避潜伏期延长(P<0.05),p-AMPK、MDA、ROS、NSE、Tau的水平显著增加(^(均)P<0.05),但p-mTOR、SOD、GSH、GPX4、NeuN、FSP1的水平显著下调(^(均)P<0.05)。结论Klotho通过激活AMPK/mTOR信号通路缓解CCH大鼠海马神经元的铁死亡和氧化应激。

三丁酸甘油酯通过调节AMPK/mTOR通路改善鸡白痢沙门氏菌诱导的肝脏炎症

为探讨三丁酸甘油酯(TB)对鸡白痢沙门氏菌(SP)诱导的肝脏炎症调控机制,试验将128只1日龄健康、体重相近的海南文昌鸡随机分为对照组(Con组)、SP模型组(Mod组)、SP+恩诺沙星抗生素组(Ant组)、SP+三丁酸甘油酯组(Tre组),每组4个重复,每个重复8只。试验比较了各组雏鸡的生长性能,并通过血液生化检测、肝脏HE染色、荧光实时定量PCR和免疫组化等方法探究TB对SP所致肝脏炎症的影响及其调控机制。结果显示:①Ant组和Tre组平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和存活率均显著高于Mod组(P<0.05);②Ant组和Tre组γ-谷氨酰转移酶(GGT)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性和总胆红素(TBIL)含量显著低于Mod组(P<0.05),白蛋白(ALB)水平显著高于Mod组(P<0.05);③与Con组相比,Ant组肝脏细胞形态完整,有少量炎性细胞,Tre组肝脏细胞形态较完整,伴有少量炎性细胞浸润;④Ant组和Tre组促炎因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(INF-γ)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达水平较Mod组显著降低(P<0.05),而白细胞介素-10(IL-10)mRNA表达水平较Mod组显著升高(P<0.05);⑤恩诺沙星和TB可通过AMPK/mTOR和NF-κB通路减轻SP感染对雏鸡肝脏损伤的影响。研究表明,饲粮添加TB可显著提高SP感染雏鸡的生长性能,降低部分血液生化指标,可能通过AMPK/mTOR通路减轻SP所致的肝脏损伤,并减少促炎因子的表达以减缓肝脏炎症。

LINC00467高表达通过抑制AMPK/mTOR通路抑制细胞自噬促进肺腺癌细胞的增殖和转移

目的探讨LINC00467对肺腺癌增殖和转移的影响及参与细胞自噬的机制。方法体外培养人支气管上皮细胞16HBE和人肺腺癌细胞A549和H1299,A549和H1299细胞经慢病毒shlinc00467和shNC感染、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和AMPK抑制剂BML-275处理。分别设置shNC组、shlinc00467组、shNC+3-MA组、shlinc00467+3-MA组、shNC+BML-275组和shlinc00467+BML-275组。实时荧光定量PCR检测细胞中LINC00467的表达,TCGA数据分析组织中LINC00467的表达以及对肺腺癌患者生存率和临床分期的影响,克隆形成实验检测细胞增殖情况,Transwell实验测定细胞迁移和侵袭能力,免疫荧光染色检测LC3的表达,Western blotting检测蛋白表达,GSEA富集分析LINC00467与自噬通路的相关性。结果与16HBE细胞相比,LINC00467在A549和H1299细胞中表达增加(P<0.001)。与癌旁组织相比,肺腺癌组织中LINC00467高表达(P<0.001)且随着临床分期增加表达量增加(P<0.05),LINC00467高表达导致患者不良的总体生存率(OS,P=0.049)和第一阶段进展率(FP,P=0.026)。与shNC组相比,shlinc00467感染的A549和H1299细胞中LINC00467表达降低(P<0.001)。与shNC组相比,shlinc00467导致A549和H1299细胞克隆形成数(P<0.01)、迁移细胞数(P<0.001)、侵袭细胞数(P<0.001)减少、p-mTOR/mTOR(P<0.05)及p62(P<0.01)蛋白表达减少;p-AMPK/AMPK(P<0.05)和LC3II/I(P<0.05)增加;GSEA提示了LINC00467对自噬通路的抑制作用(|NES|>1,P<0.05,FDR<0.25)。结论LINC00467能促进肺腺癌细胞增殖和转移,可能是通过抑制AMPK/mTOR信号通路介导的自噬实现的。

基于AMPK/mTOR自噬信号通路研究达格列净对糖尿病肾病模型大鼠肾损伤改善的作用机制

目的研究达格列净对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)模型大鼠肾损伤的改善机制。方法40只清洁级Wistar雄性大鼠分为空白对照组(蒸馏水灌胃)、模型组(蒸馏水灌胃)、达格列净低剂量组[达格列净片1 mg/(kg·d)灌胃]、达格列净高剂量组[达格列净片10 mg/(kg·d)灌胃]各10只,干预12周。观察各组大鼠体质量、24 h尿量、24 h尿蛋白、随机血糖、血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)的差异;苏木精-伊红染色观察各组大鼠肾脏组织病理变化;免疫组化检测各组大鼠肾组织腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达;实时荧光PCR(qRT-PCR)检测各组大鼠肾组织AMPK、mTOR mRNA表达。结果空白对照组、达格列净高剂量组、达格列净低剂量组、模型组大鼠体质量依次降低,24 h尿量、随机血糖、24 h尿蛋白、BUN、Scr依次升高,组间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。模型组、达格列净低剂量组、达格列净高剂量组大鼠肾脏组织病理变化比较,肾小球大小逐渐恢复,细胞排列依次紧密有序,肾小管上皮细胞空泡样变性逐渐减小,细胞排列整齐度依次增加,出血减少。空白对照组、达格列净高剂量组、达格列净低剂量组、模型组大鼠肾脏组织AMPK蛋白表达[(0.36±0.03)、(0.27±0.02)、(0.21±0.02)、(0.18±0.02)]依次降低(P<0.01),mTOR表达[(0.13±0.02)、(0.17±0.02)、(0.26±0.02)、(0.31±0.03)]依次升高(P<0.01),AMPK mRNA相对表达量[(1.00±0.08)、(0.77±0.07)、(0.52±0.05)、(0.26±0.03)]依次降低(P<0.01),mTOR mRNA相对表达量[(1.00±0.06)、(1.17±0.08)、(1.76±0.13)、(2.31±0.16)]依次升高(P<0.01)。结论达格列净可激活AMPK/mTOR自噬信号通路,保护肾小球滤过屏障,减少蛋白尿,延缓DN大鼠的疾病进程。

高良姜素调节SIRT1/AMPK/mTOR信号通路对脂多糖诱导的大鼠关节软骨细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨高良姜素调节沉默信息调节因子1(SIRT1)/增强腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的大鼠关节软骨细胞自噬和凋亡的影响。方法将大鼠关节软骨细胞分为对照组,模型组(1.0μg·mL^(-1)LPS),高良姜素低(1.0μg·mL^(-1)LPS+10μmol·L^(-1)高良姜素)、中(1.0μg·mL^(-1)LPS+20μmol·L^(-1)高良姜素)、高(1.0μg·mL^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)高良姜素)剂量组,高良姜素高剂量+EX527(SIRT1抑制剂)组(1.0μg·mL^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)高良姜素+40μmol·L^(-1)EX527)。用流式细胞术检测关节软骨细胞凋亡;丹酰尸胺(MDC)染色观察关节软骨细胞自噬;酶联免疫吸附法检测细胞中白细胞介素1β(IL^(-1)β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6水平;Western Blot法检测苄氯素(Beclin)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/Ⅰ、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、SIRT1、AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、mTOR、p-mTOR表达情况。结果与对照组比较,模型组MDC阳性细胞比例,Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2、SIRT1蛋白表达及p-AMPK/AMPK比值均降低(P<0.05);细胞凋亡率、IL^(-1)β、TNF-α、IL-6水平、Bax蛋白表达、p-mTOR/mTOR比值均升高(P<0.05)。与模型组比,高良姜素低、中、高剂量组的MDC阳性细胞比例及Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2、SIRT1蛋白表达及p-AMPK/AMPK比值均增加(P<0.05);细胞凋亡率、IL^(-1)β、TNF-α、IL-6水平、Bax蛋白表达及p-mTOR/mTOR比值均降低(P<0.05)。与高良姜素高剂量组比较,高良姜素高剂量+EX527组的MDC阳性细胞比例及Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2、SIRT1蛋白表达以及p-AMPK/AMPK比值明显降低(P<0.05),细胞凋亡率IL^(-1)β、TNF-α、IL-6水平、Bax蛋白表达、p-mTOR/mTOR比值明显升高(P<0.05)。结论高良姜素能促进LPS诱导的关节软骨细胞自噬,抑制细胞凋亡,可能是通过激活SIRT1/AMPK/mTOR信号通路发挥作用。

温阳健脾方调节AMPK/mTOR/ULK1通路上调RSA小鼠孕期自噬水平改善其蜕膜化的机制研究

目的:探讨温阳健脾方通过影响AMPK/mTOR/ULK1信号轴调控RSA小鼠孕期自噬水平,从而对其蜕膜化影响的机制研究。方法:CBA/J雌鼠与BALB/c雄鼠合笼建立空白组10只,CBA/J雌鼠与DBA/2雄鼠合笼建立RSA小鼠模型,随机将其分为模型组、温阳健脾方中剂量组,10只/组;于妊娠第1天开始,温阳健脾方组予温阳健脾方13.96 g/(kg·d)灌胃,空白组及模型组予以等体积0.9%氯化钠溶液,连续干预14 d后眼球取血,取蜕膜组织,计算胚胎丢失率,ELISA测定各组小鼠血清中胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)和催乳素(PRL),HE染色观察小鼠子宫内膜形态,Western blot法测定小鼠蜕膜组织AMPK、p-AMPK、p-mTOR、p-ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p62表达。结果:与空白组相比,RSA模型组胚胎吸收率显著降低(P<0.01);血清中IGFBP-1、PRL降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相对表达量显著下调(P<0.001),p-AMPK/AMPK、Beclin1蛋白相对表达量明显下降,mTOR、ULK1、p62蛋白表达水平显著上调(P<0.01);与模型组比较,温阳健脾方组胚胎吸收率明显降低(P<0.05);血清中IGFBP-1、PRL水平上升(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK、Beclin1蛋白相对表达量均上调,mTOR、ULK1、p62蛋白相对表达量下调(P<0.05)。结论:温阳健脾方可通过AMPK/mTOR/ULK1通路促进RSA小鼠孕期自噬水平从而改善其蜕膜化,有效提高妊娠率。

苦参碱调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对七氟烷致新生大鼠线粒体自噬的影响

目的探讨苦参碱调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对七氟烷致新生大鼠线粒体自噬的影响。方法将新生大鼠分为对照组、七氟烷组、七氟烷+苦参碱低、高剂量组、七氟烷+苦参碱高剂量+Compound C(AMPK抑制剂)组,每组15只。ELISA法检测血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和IL-1β水平;HE染色观察海马组织损伤情况,TTC染色法检测大鼠脑梗死面积,TUNEL染色法检测大鼠脑正在细胞凋亡率,透射电子显微镜观察线粒体自噬情况;蛋白质印迹法检测大鼠自噬LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Parkin、PINK1、p62和AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白。结果与对照组相比,七氟烷组大鼠海马神经元显著损伤,血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、脑组织细胞凋亡率、脑梗死面积、p62蛋白表达显著升高,自噬小体和自噬溶酶体数量、脑组织中Parkin、PINK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1蛋白表达显著降低(P<0.05);与七氟烷组相比,七氟烷+苦参碱低、高剂量组大鼠海马神经元损伤显著减轻,血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、脑组织细胞凋亡率、脑梗死面积、p62蛋白表达显著降低,自噬小体和自噬溶酶体数量、脑组织中Parkin、PINK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1蛋白表达显著升高(P<0.05);抑制剂Compound C可逆转苦参碱对新生大鼠神经元的保护作用。结论苦参碱通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路增强线粒体自噬水平来减轻七氟烷诱导的新生大鼠神经元凋亡和炎性反应。

芹菜素通过AMPK/mTOR通路调控肺癌A549细胞自噬

目的 探讨芹菜素(APG)对肺癌A549细胞增殖及自噬的影响及其与AMPK/mTOR通路的关系。方法 体外培养肺癌A549细胞,采用CCK-8法检测不同浓度芹菜素处理A549细胞不同时间后对细胞增殖的影响。后续实验分为空白对照组(0μmol/L APG),低、中、高浓度实验组和抑制剂组5组,采用MDC染色法检测各组对细胞自噬的影响,免疫印迹法检测自噬相关蛋白以及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达情况。结果 芹菜素可显著抑制A549细胞增殖,且呈浓度依赖性(P<0.05);20、40、80μmol/L芹菜素组随作用时间延长,对A549细胞的增殖抑制率逐渐增加,呈时间依赖关系(P<0.05)。与空白对照组比较,实验组A549细胞中含高亮点状荧光的自噬小泡数量及IOD值逐渐增加(P<0.05),芹菜素可浓度依赖性上调LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-AMPKα蛋白表达水平及p-AMPKα/AMPKα比值(P<0.05),下调p-mTOR、p62蛋白表达水平及p-mTOR/mTOR比值(P<0.05)。与高浓度实验组比较,抑制剂组细胞中含高亮点状荧光的自噬小泡减少,IOD值下降,LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-AMPKα蛋白表达水平及p-AMPKα/AMPKα比值降低,而P62、p-mTOR蛋白表达水平及p-mTOR/mTOR比值升高(P<0.05)。结论 芹菜素能抑制肺癌A549细胞增殖,诱导其自噬,作用机制可能与AMPK/mTOR通路有关。

银杏内酯K调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨银杏内酯K(GK)调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响。方法 取对数生长期的MCF-7细胞,设置分组为对照组、GK低浓度(GK-L,12.5μg/mL)组、GK中浓度(GK-M,25μg/mL)组、GK高浓度(GK-H,50μg/mL)组、GK-H+AMPK抑制剂(Compound C,50μg/mL GK+50μmol/L Compound C)组。观察各组细胞形态以及细胞增殖、凋亡、自噬状况并分析自噬相关基因LC3、P62、Beclin1 mRNA表达以及AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、LC3、P62、Beclin1表达。结果 与对照组相比,GK-L、GK-M、GK-H组细胞自噬泡数量增多,增殖率、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、p62表达显著下降,凋亡率、LC3、Beclin1表达、AMPK蛋白表达显著增加(P<0.05);与GK-H组相比,GK-H+Compound C组细胞自噬泡数量减少,增殖率、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、p62显著增加,凋亡率、LC3、Beclin1表达、AMPK蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 GK可以诱导乳腺癌细胞自噬和凋亡、抑制其增殖,可能与激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路有关。