强记汤通过激活AMPKα/SIRT1/PGC-1α信号通路减轻D-半乳糖诱导的认知损伤和线粒体功能障碍

目的:探讨强记汤对D-半乳糖诱导的线粒体功能障碍的作用及其机制。方法:80只C57BL/6小鼠被随机分配至空白组、模型组、二甲双胍组和强记汤组。对空白组以外的其他3组小鼠背颈部皮下注射D-半乳糖(100 mg·kg^(-1)·d^(-1)),连续8周,以建立衰老相关的认知损伤模型。强记汤组给予强记汤水煎液(24.96 g·kg^(-1)·d^(-1))灌胃,二甲双胍组给予二甲双胍(0.2 g·kg^(-1)·d^(-1))灌胃,空白组和模型组灌胃等体积生理盐水(20 mL·kg^(-1)·d^(-1)),连续灌胃4周,每天1次。Morris水迷宫实验和新物体识别实验评估小鼠的学习记忆力;Fluoro-Jade B(FJB)染色观察海马区受损的神经元;透射电镜观察海马区线粒体的超微结构;试剂盒检测活性氧(ROS)水平;JC-1染色检测海马神经细胞线粒体膜电位水平;试剂盒检测海马组织线粒体ATP及线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ含量;Western blot检测海马组织中AMP活化蛋白激酶α(AMPKα)、第172位苏氨酸磷酸化的AMPKα(p-AMPKα-Thr172)、沉默信息调节因子1(SIRT1)、过氧化物酶体增殖物受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)、NRF2和线粒体转录因子A(TFAM)水平。结果:Morris水迷宫实验和新物体识别实验结果显示,与模型组比较,二甲双胍组和强记汤组小鼠逃避潜伏期显著缩短(P<0.05或P<0.01),穿越平台次数、目标象限驻留时间及新物体识别指数显著增加(P<0.05或P<0.01)。FJB染色结果显示,与模型组比较,二甲双胍组和强记汤组小鼠海马CA1和CA3区FJB标记的神经元数量显著减少(P<0.05或P<0.01)。透射电镜显示,与模型组比较,二甲双胍组和强记汤组小鼠海马神经细胞中线粒体损伤减轻,且线粒体的长度和面积显著增加(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,二甲双胍组和强记汤组小鼠海马神经细胞中ROS水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。JC-1染色结果显示,与模型组比较,二甲双胍组和强记汤组小鼠海马神经细胞线粒体膜电位显著升高(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,二甲双胍组和强记汤组小鼠海马组织线粒体ATP及线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。Western blot结果显示,与模型组比较,二甲双胍组和强记汤组小鼠海马p-AMPKα-Thr172、SIRT1、PGC-1α、NRF1、NRF2和TFAM水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:强记汤可通过激活AMPKα/SIRT1/PGC-1α信号通路减轻D-半乳糖诱导的认知障碍、神经元损伤及线粒体功能障碍。

不同强度运动对AMPKα2三种不同基因状态鼠MEF2/GLUT4 DNA结合活性的影响

目的:研究不同强度跑台运动对AMPKα2三种不同基因状态鼠MEF2/GLUT4DNA结合活性及GLUT4基因表达的影响,以探讨运动提高骨骼肌MEF2/GLUT4DNA结合活性及GLUT4基因表达可能机制。方法:野生小鼠和AMPKα2高表达转基因小鼠,AMPKα2基因敲除小鼠各30只,分别随机分为安静对照组、低强度(12m/min)跑台运动组和高强度(20/min)跑台运动组。运动时间均为1h。运动后3h取材。Westernblot法测定AMPK(THr72)磷酸化水平。CHIP法测定MEF2/GLUT4DNA结合活性。Real-TimePCR法测定GLUT4mRNA含量。结果:1)野生鼠1h不同强度跑台运动后,GLUT4基因表达量显著增加的同时,伴随着骨骼肌核内MEF2/GLUT4DNA结合活性的显著增加;2)AMPKα2高表达转基因鼠1h不同强度跑台运动后,其骨骼肌细胞核内MEF2/GLUT4DNA结合活性及GLUT4基因表达量,均比野生鼠增加更为显著;3)AMPKα2敲除鼠1h不同强度跑台运动后,骨骼肌核内MEF2/GLUT4DNA结合活性显著低于野生鼠,但GLUT4基因表达量与野生鼠相比没有显著差异。结论:1)运动通过提高MEF2/GLUT4DNA结合活性而提高GLUT4表达;2)AMPKα2参与调解了运动诱导的MEF2/GLUT4DNA结合活性及GLUT4基因表达量的升高;3)虽然AMPKα2参与调节了运动诱导的MEF2/GLUT4DNA结合活性的提高,但机体还可以募集其他的信号通路代偿AMPKα2对GLUT4表达的调节作用。

低氧、低氧训练对AMPKα2三种不同基因状态鼠骨骼肌GLUT4表达及肌糖原含量的影响

目的:研究2周低氧、低氧训练对AMPKα2三种不同基因状态鼠骨骼肌GLUT4表达及肌糖原含量的影响,以探讨低氧、低氧训练对小鼠骨骼肌GLUT4基因和蛋白表达的影响及可能机制。方法:野生小鼠和AMPKα2高表达转基因小鼠,AMPKα2基因敲除小鼠各30只,分别随即分为常氧对照组、低氧暴露组和低氧训练组。低氧暴露组小鼠于低氧房(模拟海拔4000m高度,氧浓度约为12.3%)低氧暴露2周,低氧训练组小鼠2周低氧暴露同时每天于同浓度低氧房中跑台运动1h,跑台速度12m/min。最后一次跑台训练后12h取材,测定小鼠骨骼肌GLUT4基因和蛋白表达、AMPKα2蛋白表达以及肌糖原水平。结果:1)野生鼠,2周低氧暴露以及2周低氧训练后GLUT4基因和蛋白含量,与常氧对照组相比均显著增加,且低氧训练组小鼠比低氧暴露组增加更为显著。2)AMPKα2的高表达小鼠与野生鼠相比,2周低氧暴露后GLUT4蛋白和基因含量并没有显著差异,而经过2周低氧训练后,AMPKα2的高表达鼠骨骼肌GLUT4蛋白和基因表达量比野生鼠增加更为显著。3)AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌GLUT4表达量2周低氧训练后与野生鼠相比无显著差异,而2周低氧暴露后显著低于野生鼠。结论:1)低氧及低氧训练均能引起骨骼肌GLUT4表达的增多,且低氧和训练引起的GLUT4表达的增多可能有叠加效应。2)在低氧+训练双重刺激下,AMPKα2的高表达参与了调节GLUT4基因和蛋白表达的增加。3)低氧暴露引起的GLUT4基因和蛋白表达的增加至少部分是依赖AMPKα2调节,而在低氧+训练双重刺激下,机体还可以募集其他的信号通路完全代偿AMPKα2对GLUT4表达的调节作用。

大黄素对糖尿病肾病小鼠AMPKα1/TLR4/p65信号通路的影响

目的观察大黄素(Emodin)对糖尿病肾病(DN)模型小鼠AMPKα1/TLR4/p65信号通路的影响。方法采用SPF级雄性KK-Ay小鼠,经高脂饲料诱导3周建立DN模型,将30只模型成功KK-Ay小鼠随机分为模型组,阳性药组,大黄素高、中、低剂量组,每组6只,另将6只雄性C57BL/6J小鼠设为正常组,分组后大黄素低剂量组由于操作失误导致1只小鼠死亡。正常组及模型组予去离子水10 ml/(kg·d),阳性药组予缬沙坦13.33 mg/(kg·d),大黄素各组分别予大黄素13.33 mg/(kg·d)、6.67 mg/(kg·d)、3.33 mg/(kg·d)灌胃。各组小鼠每日灌胃1次,连续干预治疗12周,留取血清及肾组织标本。以RT-PCR技术检测肾组织AMPKα1、TLR4、p65、白介素-6(IL-6)、白介素-18(IL-18)mRNA转录水平;Western blot技术及免疫组化技术检测肾组织AMPKα1、p65蛋白表达水平;ELISA技术检测血清中IL-6、IL-18的表达情况。结果与正常组比较,模型组小鼠AMPKα1 mRNA转录及蛋白表达水平明显下降(P<0.01);TLR4 mRNA表达水平明显上升(P<0.01);p65、IL-6、IL-18 mRNA转录及蛋白表达水平明显上调(P<0.01)。与模型组比较,各用药组AMPKα1 mRNA转录及蛋白表达水平上调(P<0.01,P<0.05);各用药组TLR4、p65、IL-6、IL-18mRNA及蛋白转录水平显著下调(P<0.01,P<0.05)。结论大黄素降低IL-6、IL-18等促炎因子表达,减轻DN免疫炎性损伤作用可能与上调AMPKα1活性,抑制TLR4/p65信号通路,减少下游炎症因子释放有关。

不同强度运动对AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌葡萄糖运载体4表达的影响

目的:探讨不同强度运动对AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌葡萄糖运载体4(GLUT4)基因和蛋白表达的影响。方法:野生和AMPKα2基因敲除小鼠各30只,并分别随机分为安静对照组、低强度(12m/min)跑台运动组和高强度(20m/min)跑台运动组,每组10只。运动时间均为1小时。运动后即刻取材,测定骨骼肌GLUT4基因和蛋白表达、AMPKα2蛋白表达以及肌糖原、血糖、血清胰岛素水平。结果:无论野生型还是AMPKα2基因敲除小鼠,1小时不同强度一次性跑台运动后GLUT4 mRNA含量与安静组相比均显著增加。无论安静状态或1小时不同强度跑台运动后,AMPKα2基因敲除小鼠GLUT4基因和蛋白含量与野生小鼠相比均无显著差异。1小时不同强度跑台运动后,AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌肌糖原含量均显著低于野生鼠。野生或AMPKα2基因敲除小鼠,低强度跑台运动组血糖含量显著低于安静组,而高强度跑台运动组与安静组相比无显著差异。结论:不同强度一次性运动后,敲除AMPKα2基因虽然影响了运动小鼠肌糖原的消耗,但未影响骨骼肌GLUT4基因和蛋白含量变化,提示AMPKα2可能并非是一次性运动诱导的骨骼肌GLUT4蛋白和基因含量变化的唯一调节信号。

AMPKα2基因多态性作为中国北方汉族人群心脏耐力训练敏感性分子标记的可行性研究

目的:研究腺苷酸激活的蛋激酶α2亚基(AMPKα2)基因区的7个标签单核苷酸多态性位点(SNP)及其组成的单体型与有氧耐力训练前后心脏结构和功能敏感性指标变化之间的相关性,探讨其作为有氧耐力训练敏感性分子标记的可行性。方法:对102名中国北方汉族青年进行为期18周的有氧耐力训练,测定训练前后安静时、不同负荷状态下(50 W、100 W、150 W)以及恢复期的心脏结构和功能相关指标。采用MALDI-TOF MS方法解析受试者基因组DNA多态位点基因型,分析训练前后相关指标的变化与基因型之间的关联性。结果:1)rs1418442、rs11206889以及部分单体型与心脏结构指标室间隔舒张末厚度(IVSD)和左心室质量指数(LVMI)的训练敏感性相关联;2)部分单体型与心脏功能指标150 W负荷下每搏输出量指数(SVI)的训练敏感性相关联。结论:AMPKα2基因的部分基因型或单体型可以作为中国北方汉族人群心脏对耐力训练敏感的分子标记。

通心络和人参总皂苷对过度疲劳致血管内皮功能障碍大鼠主动脉CPT-I和AMPKα表达的干预作用

目的观察通心络和人参总皂苷对过度疲劳致血管内皮功能障碍大鼠主动脉CPT-I和AMPKα表达的干预作用。方法采用"基础饮食+负重游泳法"建立疲劳应激动物模型,给予通心络和人参总皂苷进行干预,观察大鼠一般状况、主动脉内皮细胞形态和结构,血中ET-1和NO水平,采用Real-Time PCR检测主动脉CPT-I、AMPKαmRNA表达,Western blot检测主动脉CPT-I、AMPKα、p-AMPKα蛋白表达。结果过度疲劳应激可导致血管内皮结构和分泌功能损伤,同时CPT-I、AMPKαmRNA和蛋白表达降低;通心络和人参总皂苷可保护血管内皮结构和功能完整性,升高CPT-I、AMPKαmRNA和CPT-I、AMPKα、p-AMPKα蛋白表达。结论通心络和人参总皂苷可通过增强血管AMPK mRNA基因和蛋白表达及p-AMPKα蛋白表达,进而调控血管局部与脂质β氧化相关的CPT-I mRNA和蛋白表达,从而对过度疲劳大鼠血管内皮发挥保护作用。

耐力训练对AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1表达的影响

目的:研究耐力训练对AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1mRNA和蛋白表达的影响,探讨耐力训练中AMPKα2调节脂肪酸代谢的可能途径。研究方法:两月龄C57BL/6J野生(WT)和AMPKα2基因敲除(KO)小鼠各20只,各自随机分为安静对照组,耐力训练组,每组10只。两训练组进行4周,每天1 h,速度为12 m/min的跑台训练,测定股四头肌CPT-1 mRNA和蛋白表达以及血清FFA、TG水平。结果:4周耐力训练之后,WT鼠和KO鼠骨骼肌CPT-1 mRNA和蛋白表达,与安静对照组相比均显著升高,且两训练组之间无显著差异。结论:耐力训练中AMPKα2不是CPT-1的唯一上游调节因子,可能有其他途径参与CPT-1表达的调节。

莫诺苷通过AMPKα/PGC-1α/GLUT4通路对糖尿病大鼠缺血再灌注损伤的保护作用

目的:心血管并发症是糖尿病患者发病和死亡的主要原因。本文旨在探索莫诺苷对糖尿病大鼠缺血再灌注损伤的影响及其机制。方法:利用高糖饮食联合链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠模型。冠状动脉结扎术建立缺血再灌注模型。糖尿病大鼠随机分为4组:对照组(DM);对照加药组(DM+莫诺苷);模型组(I/R+DM);加药组(I/R+DM+莫诺苷)。苏木素伊红(HE)染色分析组织病理学变化。ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10水平和氧化应激指标SOD和MDA水平。蛋白印迹检测肌红蛋白(Mb)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(c Tn I)、AMPKα1、PGC-1α和GLUT4的表达。结果:与对照组相比,模型组平均动脉压(MAP)、心率(HR)和左心室收缩压(LVSP)明显降低,心肌梗死面积增大(P<0.05)。与模型组相比,加药组MAP、HR和LVSP明显升高,心肌梗死面积明显变小(P<0.05)。同时,莫诺苷可改善糖尿病大鼠缺血再灌注导致的心肌组织病变。模型组Mb、CK-MB和c Tn I表达明显高于对照组(P<0.05)。加药组Mb,CK-MB和c Tn I表达明显低于模型组(P<0.05)。与对照组相比,模型组TNF-α和IL-6水平明显升高,IL-10水平明显下降(P<0.05)。与模型组相比,加药组TNF-α和IL-6水平明显降低,IL-10水平明显上升(P<0.05)。而且,模型组SOD水平明显低于对照组,MDA水平明显高于对照组(P<0.05)。与模型组相比,加药组SOD水平升高,MDA水平降低(P<0.05)。另外,模型组AMPKα1、PGC-1α和GLUT4的表达明显低于对照组(P<0.05)。加药组AMPKα1、PGC-1α和GLUT4的表达明显高于模型组(P<0.05)。结论:莫诺苷通过激活AMPKα/PGC-1α/GLUT4通路减轻糖尿病大鼠缺血再灌注损伤。

低氧训练对AMPKα2三种基因状态鼠骨骼肌HIF-1α mRNA表达的影响

目的:探讨低氧耐力训练对AMPKα2基因敲除(KO)、高表达转基因(OE)及野生型(WT)小鼠骨骼肌HIF-1α mRNA表达的影响。方法:WT、KO及OE鼠各30只,分别随机分为常氧对照组、低氧暴露组和低氧训练组。常氧对照组在常氧状态下饲养14天;低氧暴露组在低氧环境(模拟海拔4000米高度,氧浓度约12.3%)下饲养14天;低氧训练组在与低氧暴露组相同的低氧环境下饲养并连续14天进行跑台训练(12 m/min,1 h/day)。14天后断食12 h取材,测定小鼠骨骼肌AMPKα2蛋白和HIF-1α mRNA表达。结果:(1)OE和WT鼠低氧暴露组、低氧训练组骨骼肌AMPKα2蛋白表达与常氧对照组相比均无显著性差异,KO鼠骨骼肌无AMPKα2蛋白表达。(2)OE鼠、KO鼠和WT鼠低氧训练组骨骼肌HIF-1α mRNA表达量与低氧暴露组相比显著增加。(3)低氧训练下,OE鼠骨骼肌HIF-1α mRNA表达量与WT鼠相比有显著性差异。结论:低氧训练中AMPKα2对骨骼肌HIF-1α mRNA表达起重要作用,但并非HIF-1α表达的必要条件。

尾静脉注射AMPKα1高表达腺病毒对抑郁症模型大鼠线粒体损伤和代谢的调节作用

目的:探究尾静脉注射腺苷酸活化蛋白激酶α1(AMPKα1)高表达腺病毒对抑郁症模型大鼠线粒体损伤和代谢的调节作用。方法:采用不可预见温和应激法建立大鼠抑郁症模型,尾静脉注射AMPKα1高表达腺病毒。Morris水迷宫实验评价大鼠记忆力,旷场实验评价大鼠自主探究行为,HE染色观察大鼠海马和前额叶皮质区病理改变情况,Western blot检测AMPKα1、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、PGC-1α和GLUT4蛋白表达,试剂盒检测SOD、MDA和LDH含量,RT-PCR检测AMPKα1、PGC-1α和GLUT4 mRNA表达。结果:与CUMS+Ad-NC组相比,CUMS+Ad-AMPKα1组大鼠AMPKα1 mRNA和蛋白表达显著上调,逃避潜伏期时间显著缩短,目标象限记忆时间显著延长,水平活动次数和垂直站立次数显著增加,脑损伤显著减轻,Bcl-2蛋白表达显著上调,Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达显著下调,SOD含量显著增多,LDH和MDA含量显著减少,PGC-1α和GLUT4表达显著上调。结论:尾静脉注射AMPKα1高表达腺病毒可改善抑郁症模型大鼠学习记忆能力、自主探究行为和糖代谢,缓解脑损伤、线粒体损伤和氧化应激,从而缓解抑郁症。

AMPKα2在主动脉夹层形成中的作用及机制

目的:研究AMPKα2蛋白在主动脉夹层(AD)形成中的作用。方法:通过临床标本收集和体外实验,检测主动脉组织磷酸化AMPKα(Thr172)表达水平、血管平滑肌细胞表型转化、基质金属蛋白酶及炎症通路激活情况。结果:通过临床标本检测,发现AD患者主动脉组织磷酸化AMPKα(Thr172)表达下调,血管平滑肌细胞发生表型转化,基质金属蛋白酶表达上调及炎症通路激活。体外实验采用AMPKα2质粒和相应突变失活型DN-AMPKα2(T172A)质粒转染原代大鼠主动脉血管平滑肌细胞,予以AngⅡ(10μmol/L)刺激24 h,发现过表达AMPKα2可缓解AngⅡ诱导的磷酸化AMPKα(Thr172)下调,减轻血管平滑肌细胞表型转化、基质金属蛋白酶表达及炎症通路激活。而过表达失活型DN-AMPKα2(T172A)加重上述病理改变。结论:AMPKα2促进磷酸化AMPKα(Thr172)表达,缓解主动脉血管平滑肌细胞表型转化、基质金属蛋白酶表达上调及炎症通路激活。

pFLAG-AMPKα2真核表达质粒构建及对心肌缺氧/复氧损伤的作用

目的:构建大鼠pFLAG-AMPKα2真核表达质粒,分析AMPKα2过表达对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。方法:提取H9c2心肌样细胞的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增AMPKα2基因的cDNA全长,并将其克隆至pFLAG-CMV-4构建pFLAG-AMPKα2重组质粒。转染pFLAG-AMPKα2至H9c2细胞,West-ern Blot测定AMPKα2的蛋白表达情况,建立缺氧/复氧(A/R)损伤模型,MTT法检测心肌细胞的存活率,生物自动分析仪检测LDH活性,流式细胞术检测各实验组心肌细胞凋亡程度、细胞内ROS的变化,试剂盒检测细胞内抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活性。结果:AMPKα2全长基因序列克隆至真核表达载体pFLAG-CMV-4,酶切鉴定片段大小为1700bp,Western blot检测转染pFLAG-AMPKα2后,AMPKα2蛋白在H9c2细胞中高表达。H9c2细胞遭受A/R损伤,心肌细胞存活率下降,LDH活性增加,细胞凋亡加重,ROS生成增加,SOD及GSH-Px的酶活性下降,pFLAG-AMPKα2重组质粒的导入可明显逆转、改善上述各项指标,从而对抗A/R损伤。结论:构建成功的pFlAG-AMPKα2重组质粒能对抗A/R所致的心肌细胞损伤,其机制与改善心肌细胞的氧化应激作用有关。

4周有氧训练诱导AMPKα_2对小鼠骨骼肌Nrf_2-ARE结合活性的影响

目的:探讨4周有氧训练诱导AMPKα_2对小鼠骨骼肌Nrf_2-ARE结合转录活性的影响及可能机制。方法:AMPKα_2转基因(TG)小鼠及其野生型(WT),随机分为对照组和训练组,每组各10只。训练组每天进行坡度为0、速度为12 m/min的跑台训练、1 h/天、6天/周,持续4周。对照组不参与训练。最后一次跑台训练结束48 h后取材,测定骨骼肌Nrf_2-ARE结合活性、抗氧化酶m RNA和蛋白表达以及骨骼肌ROS含量。结果:4周有氧训练后:1)WT和TG小鼠骨骼肌ROS水平、Nrf_2-ARE结合活性显著增加(P<0.05);与训练组WT鼠相比,训练组TG鼠骨骼肌ROS水平显著降低,Nrf_2-ARE结合活性显著增加(P<0.05)。2)训练组WT鼠骨骼肌HO-1 m RNA和训练组TG鼠骨骼肌(Gpx-1、NQO-1、HO-1、CAT)m RNA表达显著增加(P<0.05)。3)训练组WT鼠骨骼肌蛋白(CAT、SOD1、HO-1、GSR,P<0.05)表达,训练组TG鼠骨骼肌蛋白(Gpx-1、CAT、SOD2、NQO-1,P<0.05)和(GCLc、SOD1、HO-1、GSR,P<0.01)表达显著增加;与训练组WT鼠相比,训练组TG鼠骨骼肌蛋白(Gpx-1、SOD1、SOD2、HO-1、GSR、NQO-1,P<0.05)和GCLc(P<0.01)蛋白表达显著增加。结论:4周有氧训练可能诱导AMPKα_2,促进Nrf_2-ARE结合活性,进而增加抗氧化酶的蛋白表达,提高机体抗氧化能力。

夹脊电针对脊髓损伤大鼠AMPKα-HDAC5-HIF-1α信号级联的调控作用研究

目的探讨电针“夹脊穴”调控AMPKα-HDAC5-HIF-1α信号级联对脊髓损伤(SCI)大鼠的治疗机制。方法60只Wister大鼠按体质量随机均分为假手术组、模型组和夹脊电针组,将3组再分为治疗7 d与28 d 2个亚组,每个亚组各10只。除假手术组外,其余大鼠采用重物坠落法(WD)制备SCI模型,造模成功后,夹脊电针组给予电针“夹脊穴”治疗7 d和28 d,采用BBB评分量表和斜坡试验评价大鼠后肢功能、平衡功能的恢复情况;HE染色观察大鼠脊髓组织病理形态学变化,免疫组织化学法检测脊髓组织中Brdu的阳性表达,Western-blot及RT-PCR检测脊髓组织中AMPKα、HDAC5、HIF-1α的蛋白和mRNA表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠造模7 d与28 d后BBB评分和斜坡角度明显降低,脊髓组织病理损伤严重,Brdu的阳性细胞数显著增多,HIF-1α的蛋白和mRNA表达明显上调(P<0.01),AMPKα和HDAC5的表达水平未见明显变化(P>0.05);经夹脊电针治疗7 d与28 d后,大鼠BBB评分和斜坡角度显著升高,脊髓组织损伤明显减轻,Brdu的阳性细胞数及HIF-1α的蛋白和mRNA表达较模型组进一步上调,同时明显上调了AMPKα和HDAC5的蛋白及mRNA水平(P<0.01)。结论夹脊电针治疗可能通过促进脊髓组织中AMPKα-HDAC5-HIF-1α信号级联活化,介导损伤组织血管新生,改善SCI脊髓形态,恢复运动功能。

HBV感染通过上调MALAT1诱导AMPKα活化和巨噬细胞凋亡的功能与机制研究

目的研究长链非编码RNA MALAT1和AMPK激活在乙肝病毒HBV感染后对巨噬细胞凋亡的功能和机制,为乙肝疾病治疗探索新的潜在靶点。方法收集HBV感染者外周血单核巨噬细胞并体外培养巨噬细胞,转染HBx蛋白和MALAT1 siRNA沉默载体。细胞坏死ELISA检测试剂盒检测细胞凋亡率变化,RT-qPCR检测HBV感染者外周血单核细胞和体外培养并转染处理的巨噬细胞中MALAT1表达变化,Western blot检测细胞中cleaved-caspase-3、HBv-X、AMPKα、p-AMPKα蛋白表达变化。结果HBV-DNA阳性者外周血单核巨噬细胞中MALAT1的表达增加(P<0.05),而且高表达HBV-X蛋白可显著促进MALAT1表达(P<0.05)。高表达HBV-X蛋白促进巨噬细胞凋亡率,增加cleaved-caspase-3的表达,AMPKα表达水平以及其磷酸化水平(P<0.05)。在上调HBx蛋白的基础上沉默MALAT1,结果发现上调HBV-X蛋白诱导的巨噬细胞凋亡和p-AMPKα蛋白表达升高均被沉默MALAT1所部分逆转。结论HBV感染通过上调MALAT1诱导AMPKα活化和巨噬细胞凋亡。

AMPKα2基因敲除鼠饲养繁殖及基因鉴定

目的探讨AMPKα2基因敲除小鼠的饲养繁殖以及子代的鉴定方法,为进一步研究AMPKα2基因在糖尿病心肌病中的作用提供动物模型。方法引进的AMPKα2基因敲除小鼠均为杂合子基因型,2雌1雄同窝进行饲养繁殖,从仔鼠的尾尖提取DNA,用PCR的方法扩增目的基因片段,然后进行核酸电泳判断基因型。结果子代小鼠繁殖成功并获得野生型、敲除杂合子及敲除纯合子3种基因型。然后选用雌雄均为纯合子,按照2∶1合笼进行大量繁殖,获得了一批AMPKα2敲除纯合子基因型小鼠。结论依据正确的饲养繁殖及可靠的基因型鉴定方法,可利用AMPKα2基因杂合子小鼠繁殖出所需数量的纯合子小鼠。

AMPKα2基因克隆及其野生型和突变型真核表达载体的构建

背景:实验表明,通过激活单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-Activated Protein Kinase,AMPK)α2可以增加胰岛素的敏感性和骨骼肌葡萄糖的摄取,其有望成为预防和治疗2型糖尿病的新的生理和药理作用靶点。目的:克隆人的AMPKα2基因,并构建其野生型和突变型真核表达载体。设计:单一样本观察。时间及地点:实验于2007-04/2008-01在中山大学附属第二医院临床分子生物实验室完成。材料:QuikChangeⅡ Site-Directed Mutagenesis Kit为Stratagene公司产品。真核表达载体pcDNA3.1(+),大肠杆菌DH5α为实验室保存。人骨胳肌组织来源于中山大学附属第二医院手术截肢患者,获患者知情同意,新鲜取材后液氮冷冻。方法:采用反转录-聚合酶链反应技术从人骨骼肌扩增AMPKα2基因,并将其克隆到T载体,通过测序对其进行鉴定。采用Quickchange定点诱变试剂盒对AMPKα2基因进行体外定点诱变,并将其野生和突变的编码基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,通过酶切和测序进行鉴定。主要观察指标:①目的基因的克隆。②定点诱变。③真核表达质粒的构建。结果:成功克隆了AMPKα2基因,大小约1700bp,与已发表的AMPKα2同源性为99%,GenBank录入号EF056019。成功将AMPKα2第45位Lysine(AAA)突变为Arginine(AGA),成功构建了野生型和突变型pcDNA-AMPKα2重组质粒。结论:实验成功克隆了AMPKα2基因,构建了其野生型和突变型真核表达载体。

运用GC-MS代谢谱研究AMPKα_2基因与2型糖尿病的关系

目的探究AMPKα2基因在代谢方面的作用。方法运用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)结合化学计量学方法中的多元分辨(SIA)和模式识别方法(PCA),对AMPKα2基因敲除(AMPKα2-KO)和C57BL/6 J小鼠血清的代谢物谱进行了全面研究。结果与对照组C57BL/6J小鼠相比,AMPKα2-KO小鼠的核糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、胆固醇含量明显下降,而α-羟基丁酸、β-羟基丁酸、亚油酸含量明显升高。结论 AMPKα2基因在糖和脂肪酸代谢方面具有重要的作用。

LKB1-AMPKα-SIRT1信号通路在奶牛脂肪组织脂代谢中的调控作用

奶牛脂肪细胞体积和数目的不断增加会导致脂肪组织脂代谢的紊乱,引起一系列相关慢性疾病如Ⅱ型糖尿病、酮病、脂肪肝、高脂血症等的发生,LKB1-AMPKα-SIRT1信号通路在奶牛脂肪组织脂代谢中起着重要的调控作用。单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是比较保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,在调节能量代谢中起着枢纽作用。肝激酶B1(LKB1)属于一种丝氨酸激酶,是AMPKα的上游激酶,可参与细胞内能量代谢等多种生物活动。沉默信息调节因子1(SIRT1)是一种NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,可通过去乙酰化LKB1增加AMPKα的活性。就LKB1-AMPKα-SIRT1信号转导通路在奶牛脂肪组织脂代谢紊乱中的调控机制作一综述,旨在为下一步研究奶牛脂代谢相关信号通路调控机理提供依据。