结直肠癌中错配修复基因与Ang-1/2表达的相关性研究

目的探讨结直肠癌中错配修复基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2与Ang-1、Ang-2的表达及相关性。方法收集2015年1月~2018年12月北华大学附属医院病理科结直肠癌石蜡标本,所有病例术前均未进行放、化疗。利用免疫组化Envision法检测MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、Ang-1和Ang-2蛋白的表达,MLH1、MSH2、MSH6和PMS2为细胞核染色,Ang-1、Ang-2为细胞浆染色,阳性结果采用半定量评分标准。采用SPSS 20.0统计学软件,计数资料用频数和百分比表示,利用χ2检验、Fisher确切概率法分析MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、Ang-1、Ang-2与临床病理特征的关系,利用Spearman相关法分析MLH1、MSH2、MSH6、PMS2与Ang-1、Ang-2的相关性,P<0.05为差异有统计学意义。结果(1)MLH1、PMS2缺失与患者的性别、年龄、淋巴结转移、大体类型、组织学类型比较,差异无统计学意义(P>0.05),与发病部位、分化程度比较,差异有统计学意义(P<0.05);MSH2、MSH6缺失与患者的性别、年龄、发病部位、分化程度、淋巴结转移、大体类型、组织学类型比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)MLH1与PMS2之间显著正相关,MSH2与MSH6之间显著正相关且协同表达。(3)Ang-1、Ang-2表达与患者的性别、年龄、分化程度、发病部位、大体类型、组织学类型比较,差异无统计学意义(P>0.05),但与淋巴结转移比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)MLH1、MSH2、MSH6和PMS2缺失与Ang-1、Ang-2的表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论MLH1、MSH2、MSH6、PMS2缺失与Ang-1、Ang-2表达无显著相关性。

血管生成素1和报告基因EGFP双基因共表达腺病毒的构建

目的:构建并制备血管生成素-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法:采用基因克隆技术克隆目的基因ANG-1,并将得到的基因亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pAdTrack-CMV;使用Padeasy-1腺病毒系统将含有目的基因的穿梭载体与腺病毒骨架质粒在细菌BJ5183中同源重组,产生重组腺病毒载体;线性化重组的腺病毒转染入QBI-293A细胞中对重组的腺病毒进行包装并扩增.结果:ANG-1基因与腺病毒穿梭载体连接成功,经Xho I/EcoR V双酶切后琼脂糖电泳可见在1.5kb处出现特异性条带,证明pAdTrack-CMV-ANG-1重组质粒构建成功;重组的穿梭载体与pAdeasy-1质粒重组后,产物经PacI酶切后琼脂糖电泳可见一大一小两个片段.大小约为30kb和4.5kb,与预期结果相符,证明重组腺病毒pAd-ANG-1-EGFP构建成功;线性化重组的腺病毒转染入QBI-293A细胞后包装成功.扩增后病毒滴度为2×1014v.g./L,EGFP活性检测腺病毒感染细胞阳性率在30%以上.结论:成功制备了pAd-ANG-1-EGFP腺病毒.为骨组织工程血管化的研究打下基础.

血管生长素-1基因慢病毒载体的构建及其在间质干细胞的表达

目的:构建带有血管生长素-1(Ang-1)基因的慢病毒载体并实现该基因在大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)中的表达。方法:RT-PCR获得大鼠Ang-1基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES2-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒颗粒并感染rMSCs。PCR检测Ang-1基因的插入,细胞RT-PCR检测Ang-1mRNA表达,免疫细胞化学和Western blotting检测Ang-1蛋白的表达。结果:所获Ang-1基因经测序证实与GenBank报道的序列一致。慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES2-EGFP经SaⅠl和BamHⅠ双酶切后电泳显示1 512 bpAng-1目的基因片段和10.5 kb PNL-IRES2-EGFP载体片段。病毒基因组PCR证实Ang-1基因插入。荧光显微镜观察到EGFP表达。细胞RT-PCR检测到Ang-1mRNA表达。免疫细胞化学和Western blotting检测到Ang-1蛋白表达。结论:成功构建带有Ang-1基因的慢病毒载体并实现在rMSCs中的表达,为Ang-1基因修饰干细胞的应用研究奠定了基础。

复制缺陷的重组腺病毒介导的血管形成素-1基因的制备及其体外表达的研究

目的 :探讨重组腺病毒载体构建及其在体外的有效转录。 方法 :以RT PCR自人脾组织中克隆和筛选出血管形成素 1(Ang 1)全长cDNA ,测序鉴定正确后 ,经salI酶切并克隆到E1、E3 缺失的Ad5腺病毒载体 (PAxCAwt)中 ,应用cosmid TPC磷酸钙共沉淀法 ,将含有左向转录表达单元重组载体PAxCAwtAng 1与DNA 末端肽复合物(TPC)一同转染 2 93细胞中 ,经挑选克隆、病毒扩增、纯化、浓度滴度测定 ,制备了纯化病毒颗粒 ,以此转染人脐静脉上皮细胞 (ECV30 4) ,收集转染后 17天的细胞 ,用RT PCR检测转染细胞中外源性Ang 1基因转录。 结果 :实验所克隆的Ang 1DNA片段为含有信号肽结构的长度为 15 15bp的全长cDNA ,与文献报道一致。外源基因在转染细胞中能有效转录。 结论 :Ad5 PAxCAwt转导的血管形成素

rs2507800、rs4880、rs1799895单核苷酸多态性与中国东北地区汉族妇女子痫前期相关性研究

目的:探讨Ang-1 rs2507800、SOD2 rs4880及SOD3 rs1799895多态性与中国东北地区汉族妇女子痫前期(PE)是否存在关联。方法:采用飞行时间质谱对181例PE患者(病例组)及203例健康孕妇(对照组)的上述3个位点进行分型,分型结果采用SPSS12.0软件进行统计分析。结果:病例组与对照组rs2507800、rs4880、rs1799895等位基因频率和基因型频率均无统计学差异(P>0.05)。对rs2507800、rs4880分别在显性、隐性模型下进行分析,两组仍无统计学差异(P>0.05)。结论:rs2507800、rs4880、rs1799895多态性与PE不相关。

运动对骨骼肌血管形成相关因子基因表达影响的研究

目的:与血管形成和血管结构功能完整性有关的重要因子包括VEGF及其受体KDR、Ang-1、bFGF等。探讨大鼠在不同强度耐力运动下骨骼肌血管形成相关细胞因子基因在不同类型骨骼肌中的表达变化规律,以期揭示这些细胞因子在运动骨骼肌血管形成、维持骨骼肌结构和功能的机制;方法:采用不同运动负荷训练方案建立大鼠的运动模型,应用逆转录聚合酶链反应及计算机图像分析等方法,研究不同类型骨骼肌中血管形成与功能维持有关的因子基因表达;结果:耐力运动能使不同类型骨骼肌中与血管形成相关因子的基因发生变化,变化规律与运动强度有关;结论:耐力运动对不同类型骨骼肌中4种基因表达的影响与骨骼肌类型有关,但目前仍缺乏直接的分子学证据。