AOZ残留分析质控用虾糜自然(污染)基体标准样品的研制

为获得与实际检测样品完全一致的虾中AOZ残留分析用质控样,研制了含AOZ自然(污染)基体虾糜标准样品。通过对养殖虾适量给药和合适采集时机的选择可获得预期含量的代表实际样品原状态的自然(污染)基体阳性材料,制备的虾糜自然基体样品适用于AOZ残留分析质量控制。

酶联技术在水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的检测中的应用

用酶联免疫检验技术(ELISA)检测呋喃唑酮(Furazolidone)代谢物AOZ。AOZ经过16h的衍生后和酶联结合物对微孔中的抗体进行竞争反应,利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的基本原理,在酶标仪上450nm处测定吸光强度,进行定性定量分析。

含AOZ虾糜自然材料的实验室内快速获取方法

为快速获取含AOZ虾糜自然基体阳性材料以制备检测质量控制标准样品,建立了实验室内的自然材料获取方法。采用市售活虾在实验室条件下药浴,控制药浴液初始浓度和捞起时间,拍击式均质,密封包装和辐照灭菌等,成功获取均匀、稳定的含AOZ预期残留量虾糜自然基体阳性材料。

HPLC/MS法对呋喃唑酮及其代谢物AOZ在罗非鱼体内残留研究

采取高效液相色谱(HPLC)与质谱(MS)连用技术研究呋喃唑酮[3 (5 硝基糠醛缩氨基) 2 唑烷酮]及其主要代谢产物3 氨基 2 唑酮(AOZ)在罗非鱼体内的残留规律。该方法对呋喃唑酮及其代谢物AOZ的检出限分别为10μg/kg、1μg/kg。给罗非鱼投喂剂量为30mg/(kg·d)的呋喃唑酮药饵7d.结果表明,罗非鱼肌肉中呋喃唑酮和AOZ的含量分别在停药6h后和停药"零时"达到最高,分别为413.00±91.68μg/kg、31.15±9.68μg/kg,24h后呋喃唑酮含量就低于检出限,而肌肉中AOZ的含量在528h后才低于1μg/kg。鱼肌肉中呋喃唑酮和AOZ的消除半衰期分别为9.34h、38.2h,平均消除速率分别为22.7μg/(kg·h)、0.058μg/(kg·h)。由实验结果可以看出,鱼肌肉中呋喃唑酮代谢很快,而AOZ却很难消除。考虑到呋喃唑酮的代谢物AOZ在罗非鱼体内不容易消除,在本实验条件下,建议给罗非鱼投喂呋喃唑酮药饵的停药期至少在22d。

呋喃唑酮代谢物AOZ在斑点叉尾体内组织分布与消除规律研究

研究了在池塘网箱养殖模式下,平均水温为30.6℃,以100 mg/kg鱼体重的剂量投饲斑点叉尾(Ietalu-rus punetaus)苗种(95±20.9)g含呋喃唑酮的药饵,连续5 d,每天2次。采用高效液相色谱串联质谱(HPLC-ESI/MS/MS)法分析了呋喃唑酮主要代谢产物3-氨基-2-噁唑烷酮(3-amina-2-oxazolidinone,AOZ)在斑点叉尾体内的组织分布与消除规律。结果表明:血液、肌肉、皮肤、肝脏和肾脏中AOZ于停药后在4 h时的浓度分别为(2 649.0±463.1)ng/mL,(1 169.4±194.5)、(2 308.5±100.5)、(7 816.2±568.5)和15 938.1μg/kg,血液、肌肉、皮肤、肝脏和肾脏中AOZ在60 d时平均浓度分别为6.66 ng/mL,4.50、33.7、17.1和21.3μg/kg,分别是AOZ判定限1μg/kg的6.66、4.5、33.7、17.1和21.3倍。90 d时AOZ在血液和各组织中均检测不到。AOZ在血液和各组织中的浓度水平肾脏>肝脏>皮肤>血液>肌肉,消除半衰期T1/2皮肤(11.1 d)>肌肉(7.8 d)>血液(7.2 d)>肝脏(6.9 d)>肾脏(6.7 d)。斑点叉尾皮肤中AOZ的浓度高于肌肉组织,而且残留时间长,在此养殖条件下,AOZ在斑点叉尾各组织中消除至少需要2 754℃.d。

Design and efficient synthesis of novel haptens and complete antigens for the AOZ,a toxic metabolite of furazolidone

A good strategy was brought forward for designing efficient haptens and complete antigens for 3-amino-2-oxazolidinone （AOZ）. Haptens designed newly were achieved facilely in good yield by using LiCI-N（Et）3 as new catalysis system, the structure of which was elucidated by spectroscopy analysis, such as NMR and MS. Novel antigens for AOZ were prepared successfully by convenient active ester method. The ratios of haptens 3 and 4 to carrier proteins were proven respectively as 41 ： 1 （5a）, 39：1 （6a）, 11：1 （5b） and 9：1 （6b） by trinitrobenzene sulfonic acid （TNBS） method. The results of indirect competitive ELISA （ic-ELISA） of antiserums indicated that the haptens with a short unsaturated side chain can evoke specific immune response effectively.

酶联免疫法检测水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的残留

用酶联免疫试剂盒（灵敏度为0.125μg/kg）检测威海出口水产品中3氨基-2-恶唑烷酮（AOZ）的残留,测定试剂盒的加样回收率。结果表明除个别产品不符合规定外,绝大部分水产品符合规定,试剂盒在添加量为0.45、0.90、1.80μg/kg时,回收率分别为94.37%、98.78%、97.90%。酶联免疫法适合对水产品中AOZ的残留做快速检测。

少孢节丛孢菌Aoz1基因调控区的发掘及分析

为了确定少孢节丛孢菌内蒙古株丝氨酸蛋白酶Aoz1基因的潜在启动子区,试验采用透析膜培养的方法培养出少孢节丛孢菌内蒙古株并提取基因组DNA,与NCBI上Aoz1基因进行比对,选定Aoz1基因上游侧翼长度为2 000 bp的序列(命名为AP1)并据此设计引物,用PCR法扩增该序列并构建至平末端载体后测序,使用启动子在线预测软件Web Promoter Scan Service、NNPP以及CpG岛预测软件EMBOSS对AP1进行生物信息学分析。结果表明:所提取的基因组DNA完整性良好;成功构建出重组平末端质粒PEASY-AP1-Blunt,测序结果正确;通过相应软件预测出AP1含有的启动子基本元件,如TATA框、转录起始位点(TSS位点),以及参与Aoz1基因表达调控的转录因子结合位点Sp1、GHO、E2F、T-Ag和GCF等,同时确定了CpG岛的Obs/Exp值与GC含量的百分比分布。说明AP1序列具有启动子的基本结构和特点,初步确定了少孢节丛孢菌Aoz1基因的潜在启动子区。

呋喃唑酮代谢物(AOZ)在异育银鲫、团头鲂鱼种体内降解规律的初步研究

为研究呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)在异育银鲫、团头鲂鱼种体内的降解规律,用呋喃唑酮按30 mg·kg-1·d-1的水平投喂药饵,连喂7 d后随机抽取试验鱼,取肌肉组织进行连续采样检测,运用HPLC/MS/MS检测并分析AOZ在两种鱼类体内的消除规律。结果发现:14周后,AOZ的浓度在异育银鲫体内降解到检出限(0.5μg/kg)以下;36周后,在团头鲂体内降解到检出限以下。这一结果提示,一旦养殖鱼类被呋喃唑酮污染,很难在短时间内消除,会影响水产品的质量安全并对人体健康造成危害。

酶联免疫(ELISA)法测定水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的残留

采用MaxsignalTM AOZ快速检测试剂盒检测水产品中呋喃唑酮代谢物。通过对精密度、回收率和检测限等项目的测定,验证了方法的可行性。呋喃唑酮代谢物标准液在0.05ng/mL^4.5ng/mL范围内具有良好的线性,微孔板孔间变异系数为3.2%~7.7%。样品批内变异系数为5.2%~8.4%,批间变异系数为6.3%~8.9%,平均回收率为94.5%~98.4%。试剂盒的理论检测下限为0.05μg/Kg。该方法灵敏度高,重复性好,适用于水产品中呋喃唑酮代谢物残留的检测。

牛肉中呋喃妥因代谢物(AOZ)液相色谱/串联质谱法测定不确定度评定报告

根据RB/T 214中4.5.15测量不确定度的要求,检验检测机构应根据需要建立和保持应用评定测量不确定度的程序。检验检测机构应建立相应数学模型,给出相应检验检测能力的评定测量不确定度案例,检验检测机构可在检验检测出现临界值、内部质量控制或客户有要求时,报告测量不确定度。面对新的要求,实验室应该对检测结果做出不确定度评定,我实验室今年在CMA计量认证中成功扩项了《GB/T 21311-2007动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法》,依此方法建立了一个以呋喃妥因代谢物(AOZ)为例的不确定度典型案例,希望以此开辟先河,完善实验室建设,为其他单位实验室相关检测的开展与实施提供参考。

AOZ化学发光酶联免疫检测试剂盒的研制

以呋喃唑酮代谢物(AOZ)和卵清蛋白(OVA)偶联物为包被抗原,与AOZ样品或标准品竞争呋喃唑酮多克隆抗体,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔抗体(IgG),研制AOZ的化学发光酶联免疫检测试剂盒。以鲁米诺-过氧化氢为发光底物进行化学发光酶联免疫检测。结果表明:试剂盒分析灵敏度为0.005μg/L,比传统的ELISA试剂盒高出一个数量级,拥有更低的检测限,批内变异系数为2.1%～7.9%,批间变异系数为5.2%～9.5%,批内回收率为93%～113%,批间回收率为94%～110%。与呋喃西林代谢物(SEM)、呋喃它酮代谢物(AMOZ)及呋喃妥因代谢物(AHD)之间无明显交叉反应。此试剂盒可用于水产品中AOZ的检测。

水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的检测能力验证分析

介绍了全国多个行业51家实验室参加水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的检测能力验证计划的情况。选用活虾药浴暂养后制得并通过均匀性F检验和稳定性t检验的虾肉糜样作为测试样品,采用稳健统计技术对试验结果进行了分析。讨论了水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ检测的一些关键点。

呋喃唑酮代谢物AOZ的抗体制备及初步应用

制备呋喃唑酮代谢物AOZ的单克隆抗体并建立AOZ检测的酶联免疫分析方法。用CPAOZ-BSA免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0融合,经过筛选和克隆化后得到5株可分泌抗AOZ衍生物NPAOZ的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其中CPAOZ45D7对NPAOZ的抑制效果最好。经鉴定,CPAOZ45D7的亲和常数为2.5×109L/mol。用CPAOZ45D7包被酶标板,CPAOZ-HRP作为酶标记物建立了检测AOZ的酶联免疫分析,其曲线范围为1.3～130.0ng/mL,灵敏度为0.2ng/mL,批内变异<15%,批间变异<15%。用该方法测得AOZ在牛奶中的回收率为88%～121%

少孢节丛孢菌Aoz1基因的生物信息学分析及原核表达条件的优化

为获悉少孢节丛孢菌内蒙古株Aoz1基因的详细信息,以研究捕食线虫性真菌对线虫的作用机制,本试验以捕食线虫性真菌的代表种——少孢节丛孢菌内蒙古株为研究对象,首先扩增其胞外丝氨酸蛋白酶的基因编码序列,并进行生物信息学分析,然后将其构建至原核表达载体pET-32a中,再转化至Transetta(DE3)表达感受态细胞中,进行表达条件的优化以及表达产物的纯化。结果表明,少孢节丛孢菌内蒙古株丝氨酸蛋白酶Aoz1基因与已发表的丝氨酸蛋白酶Aoz1基因的同源性为99%,其蛋白具备螺旋结构;在原核系统中进行表达,其最适IPTG诱导浓度为1.5 mmol/L,最佳诱导时间为8 h,确定了重组蛋白的最佳表达条件,并获得了重组蛋白。对该酶基因的分析,为后续有关蛋白酶和捕食线虫性真菌杀灭寄生性线虫机理方面的研究提供了参考资料。

3-氨基-2-嗯唑烷酮半抗原、人工抗原的合成及鉴定

以2,4-二硝基氟苯为衍生剂,建立了3-氨基-2-噁唑烷酮(AOZ)的高效衍生方法,成功获得了衍生物F-AOZ,并进一步通过硝基的选择性还原合成了新的半抗原AM-AOZ,经电喷雾电离质谱(ESI-MS)和核磁共振(NMR)鉴定F-AOZ与AM-AOZ合成成功;采用重氮化法和戊二醛交联法将半抗原AM-AOZ分别与牛血清蛋白BSA和卵清白蛋白OVA进行偶联,合成了AOZ免疫原和包被原,经紫外吸收法进行成功鉴定;同时,分别采用紫外扫描法和三硝基苯磺酸法(TNBS)测定偶联比。另外,采用分子模拟手段对抗原表面半抗原决定簇的前线分子轨道分布情况进行了模拟分析,讨论了前线轨道的分布对可能获得的抗体特性的影响,为进一步制备高质量抗体提供理论支持。

呋喃唑酮代谢物人工抗原的制备与鉴定

制备了呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-噁唑烷酮(AOZ)的人工抗原,再采用重氮法将AOZ衍生物2-NP-AOZ与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA,通过SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS分析其偶联效果。以2-NP-AOZ-BSA皮下注射免疫SPF级BALB/c小鼠,分别于3次免疫和5次免疫后制备血清,以间接ELISA检测血清中2-NP-AOZ抗体效价,间接竞争ELISA检测血清敏感性,鉴定其免疫原性。发现2-NP-AOZ分别与BSA和OVA偶联成功,获得免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA;MALDI-TOF-MS分析测得偶联率分别为7.1∶1、3.8∶1;BCA试剂盒检测2-NP-AOZ-BSA、2-NP-AOZ-OVA的浓度分别为4.9、5.2 mg/mL。间接ELISA检测3次免疫后小鼠血清抗体效价均达1∶16000及以上,5次免疫后血清抗体效价均达1∶32000及以上;半数抑制浓度(IC_(50))为34.43 ng/mL,人工抗原2-NP-AOZ-BSA免疫原性优良。本研究成功合成了AOZ完全抗原,为AOZ单克隆抗体制备及快速检测方法的建立奠定了基础。

ELISA可视化微阵列芯片法检测蜂蜜中硝基呋喃类药物的残留量

ELISA可视化微阵列芯片法具有操作简单、检测速度快、检测样本量大、精确度和灵敏度好等特点,且自动化程度较高。本文主要检测了蜂蜜中的呋喃它酮代谢物AMOZ、呋喃唑酮代谢物AOZ、呋喃西林代谢物SEM和呋喃妥因代谢物AHD这四类硝基呋喃类代谢物的浓度。研究结果表明,在24组实验样品中,有两组不合格,其他均合格,蜂蜜产品质量总体较好。

呋喃唑酮代谢物分子印迹聚合物的合成及其酶联免疫吸附检测方法的建立

使用分子印迹技术,在96孔酶标板上直接合成了一种可以代替生物抗体的新型呋喃唑酮代谢物(AOZ)人工抗体,并与化学免疫发光法结合。结果表明,制得的酶标板对AOZ的灵敏度为0.008μg/L,批内变异系数为2.4%～3.6%,批内回收率为94%～110%。与SEM、AMOZ、AHD的特异性交叉反应率均小于1.0%,灵敏度高于市售ELISA商品试剂盒的0.02μg/L,同时在精密度、回收率、特异性方面无明显差异,并且可以重复使用。

呋喃唑酮代谢物人工抗原的合成及半抗原偶联比的测定

[目的]合成呋喃唑酮代谢物人工抗原,并测定该半抗原偶联比。[方法]通过混合酸酐法将羧基化改造的小分子抗原AOZ与HSA偶联后,运用紫外光谱分析判断合成的结果,并计算小分子抗原与蛋白的偶联比率。[结果]该试验成功合成了呋喃唑酮代谢物AOZ,对其进行羧基化改造后与载体蛋白HSA成功偶联,偶联比经测定为4∶1。[结论]利用紫外光谱分析测定小分子抗原偶联比率的方法简便,可靠性强。