乳癖霜外用对乳腺增生模型大鼠乳腺组织病理形态学和AP-2α、C-erbB-2表达的影响

目的研究乳癖霜外用对乳腺增生模型大鼠乳腺组织病理形态学和AP-2α、C-erbB-2蛋白表达水平的影响。方法 36只大鼠随机分为正常对照组、疾病模型组、三苯氧胺软膏组、乳癖霜小、中、大剂量组。通过雌、孕激素联合制造乳腺增生病大鼠模型,造模的同时给予不同的药物进行干预。30 d后观察各组大鼠乳腺组织病理学和脏器系数的改变,放射免疫法检测各组大鼠血清性激素的水平,Western印迹法测定各组大鼠乳腺组织AP-2α蛋白的表达水平,免疫组化测定各组大鼠乳腺组织C-erbB-2蛋白的表达水平。结果乳癖霜外用能降低乳腺增生模型大鼠的乳头直径和高度,改善模型大鼠乳腺组织病理形态学改变,调节血清性激素水平,降低模型大鼠乳腺组织中转录因子AP-2α、癌基因C-erbB-2蛋白的表达水平,与模型组比较有统计学差异(P<0.01或P<0.05)。结论乳癖霜外用对乳腺增生模型大鼠有显著的疗效,其作用机制可能为调节血清性激素水平及调节大鼠乳腺组织转录因子AP-2α、原癌基因C-erbB-2蛋白的表达水平。

子痫前期胎盘组织中AP-2α与滋养细胞凋亡、侵袭的相关性研究

目的:探讨子痫前期胎盘组织中AP-2α与滋养细胞凋亡、侵袭的相关性。方法:选取2015年11月～2017年10月间在本院分娩的子痫前期产妇68例作为子痫前期组,另取同期在本院进行分娩的健康产妇60例作为正常对照组。对比两组胎盘组织中AP-2α基因、凋亡相关基因、侵袭相关基因表达量的差异,进一步分析子痫前期胎盘组织中AP-2α基因表达量与滋养细胞凋亡、侵袭活性的内在联系。结果:子痫前期胎盘组织中AP-2αmRNA的表达量高于正常对照组;凋亡相关基因Bcl、Cx43 mRNA的表达量低于正常对照组,Bax、Caspase7、metastin mRNA的表达量高于正常对照组;侵袭相关基因HIF-1α、GPR30、MEST、Snail mRNA的表达量低于正常对照组,PEDF、RECK mRNA的表达量高于正常对照组(P<0.05)。Pearson检验发现,子痫前期胎盘组织中AP-2α基因表达量与滋养细胞凋亡相关基因、侵袭相关基因表达量均直接相关。结论:子痫前期产妇胎盘组织中AP-2α基因表达量异常增高,可正向调控滋养细胞的凋亡活力并负向调控其侵袭活力。

一类新的AP-2α转录共激活物Ku 70蛋白的鉴定

目的鉴定新的AP-2α转录共激活物,为乳腺癌的防治寻找新的靶点。方法以AP-2α为诱饵采用酵母双杂交技术寻找新的AP-2α结合蛋白,免疫共沉淀证实AP-2α与其结合蛋白的相互作用,免疫荧光技术检测AP-2α与其结合蛋白的亚细胞共定位。荧光素酶报导基因检测AP-2α结合蛋白对AP-2α转录活性的影响。结果酵母双杂交技术鉴定出Ku70蛋白为新的AP-2α结合蛋白。免疫共沉淀证实了AP-2α和Ku70蛋白在细胞内的相互作用。亚细胞共定位研究显示AP-2α和Ku70蛋白都定位于细胞核内。在功能上发现Ku70可以增强AP-2α的转录活性。结论本研究首次揭示Ku70可以结合AP-2α并促进其转录活性,证明Ku70是一类新的AP-2α的转录共激活物,提示Ku70有望成为治疗AP-2α高表达乳腺癌的新靶点。

AP-2α对大肠癌细胞侵袭生长及ER-β表达的影响

目的:研究转录因子激活蛋白-2α基因(transcription factor activator protein-2α,AP-2α)对大肠癌SW620细胞侵袭生长的影响,并探讨其对雌激素受体β基因(estrogen receptor-β,ER-β)表达的影响及其可能的分子机制。方法:利用脂质体介导重组质粒pcDNA3.1(+)-AP-2α与空质粒pcDNA3.1(+)转染入SW620大肠癌细胞,采用基质胶黏附实验与Transwell实验检测细胞的体外黏附、侵袭生长与迁移能力,采用实时定量PCR、Western blotting、免疫荧光细胞化学检测细胞中AP-2α和ER-β在基因和蛋白水平的表达,以电泳迁移率分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)方法检测转染AP-2α基因后肿瘤细胞中AP-2α的DNA结合活性及其与ER-β的结合能力。结果:AP-2α转染SW620细胞后抑制了细胞的体外黏附、侵袭与迁移能力(均P<0.05);同时细胞中ER-β基因的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05);EMSA结果显示,AP-2α转染的SW620细胞中表达的AP-2α蛋白与ER-β基因启动子区域发生特异性结合。结论:AP-2α转染SW620细胞可显著抑制大肠癌SW620细胞体外黏附、侵袭与迁移能力,其分子机制很可能与AP-2α直接作用于ER-β基因启动子区域从而影响ER-β基因的表达有关。

癌基因DEK和转录因子AP-2α协同促进乳腺癌中HER2的高表达

目的探讨癌基因DEK与转录因子AP-2α在乳腺癌变中的相互作用及在HER2过量表达、乳腺癌变中的病理学意义。方法用Western blot检测组织中DEK、AP-2α和HER2蛋白水平之间的相关性;免疫共沉淀检测DEK和AP-2α在MDA-MB-453乳腺癌细胞中的相互作用;通过siRNA抑制MDA-MB-453细胞中DEK和AP-2α的表达,用半定量RT-PCR和Western blot检测HER2的表达。结果乳腺癌组织中DEK、AP-2α和HER2的蛋白水平之间显示一定的相关性,DEK和AP-2α在MDA-MB-453细胞内有相互作用,siRNA抑制DEK和AP-2α的表达可协同抑制MDA-MB-453细胞中HER2mRNA和蛋白的表达。结论癌基因DEK和转录因子AP-2α协同促进乳腺癌中HER2的高表达。

AP-2α对基质金属蛋白酶-20作用的研究

目的:通过研究AP-2α转录因子对基质金属蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确AP-2α的功能,为研究AP-2α在釉质形成中的作用奠定基础。方法:利用RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统、染色体免疫共沉淀技术等来分析AP-2α与MMP-20启动子区域的转录调控能力。结果:小鼠成釉细胞转染AP-2αsiRNA后,成釉细胞中MMP-20 mRNA的表达水平显著上调。染色体免疫共沉淀结果显示,AP-2α可能通过与MMP-20启动子特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达。双荧光素酶报告基因检测显示预测结合位点突变后,AP-2α对MMP-20启动子的表达水平无显著影响。结论:AP-2α基因沉默可显著上调MMP-20的mRNA表达水平;而AP-2α过表达可显著抑制MMP-20活性。提示AP-2α转录因子与成釉细胞内MMP-20启动子的特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达水平。

转录因子AP-2α与TES蛋白相互作用分析

为研究转录因子AP-2α与TES蛋白的相互作用机制,分别构建AP-2α与GST的融合蛋白原核表达载体及TES与His的融合蛋白原核表达载体,在大肠杆菌E.coli BL 21中诱导表达,表达产物经纯化后用GST Pull-down及免疫印迹技术分析其相互作用关系.实验结果表明,AP-2α与TES之间存在相互作用是由于AP-2αC端能与TES C端的首个LIM结构域结合,酵母双杂交实验也证实了该结果;同时根据AP-2α只能与TES C端而不能与TES全长蛋白结合的实验事实提出了TES蛋白存在自身相互作用的可能,这种自身折叠封闭了位于TES C端首个LIM结构域上的AP-2α结合位点.

RNAi干扰AP-2α对人乳腺癌细胞HER2表达及细胞增殖的影响

目的探讨RNAi干扰转录因子AP-2α对乳腺癌细胞MDA-MB-453中HER2表达及细胞增殖的影响。方法通过siRNA抑制MDA-MB-453细胞中AP-2α的表达,采用半定量RT-PCR和Western blot法,检测其对HER2表达的影响,采用MTT法测定细胞增殖情况。结果siRNA抑制AP-2α表达后,HER2 mRNA及其蛋白水平显著下降,RNAi干扰组与对照组比较MDA-MB-453细胞生长明显受抑制(P<0.01)。结论AP-2αsiRNA可以下调乳腺癌细胞MDA-MB-453中HER2 mRNA及其蛋白的表达水平,抑制MDA-MB-453细胞的生长,提示AP-2α基因在乳腺癌细胞的发生、发展中具有重要作用,AP-2α可能是HER2过量表达乳腺癌的治疗靶点。

转录因子AP-2α与ACTN1、TES的相互作用

AP-2α是转录因子AP-2家族中的重要一员,与发育和细胞生长、分化和凋亡都有密切的联系.本文用酵母双杂交的方法筛选得到两个与转录因子AP-2α相互作用的蛋白,经测序鉴定分别为ACTN1与TES基因.在先前对AP-2α与TES基因分别克隆并在表达的基础上,进一步克隆并表达了ACTN1基因,并证实了ACTN1蛋白与AP-2α能够在体外相互作用.而且免疫共沉淀的结果表明在HeLa细胞系中过表达的AP-2α与TES蛋白能够处于同一复合体中.同时发现HeLa细胞系中,内源表达的ACTN1蛋白与GFP-TES有明显的共定位.结果提示这3种蛋白可能存在于同一个大的复合体中,通过这样的结合完成复杂的调节功能.

运用染色质免疫沉淀技术筛选AP-2α的靶基因

在后基因组时代,DNA-蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域.染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,简称ChIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法.对与ChIP有关的实验条件进行了优化,获得了较优的实验条件,并运用ChIP实验筛选出了转录因子activatorprotein-2alpha(AP-2α)的未知靶基因,对于进一步研究AP-2α的功能和调控网络打下了基础.

运用染色质免疫沉淀技术筛选出AP-2α的靶基因GALK1

在后基因组时代,DNA-蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域。与其他方法相比,染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是一种近来研究体内DNA与蛋白质相互作用的最好方法之一。本研究利用ChIP克隆方法,找出了AP-2α所调控的新的下游靶基因GALK1,并应用Lucifer-ase assay和RT-PCR实验进行了初步的验证。这一新发现,有利于我们进一步研究转录因子AP-2α的功能。

AP-2α在小鼠血管内皮细胞中上调VEGF的表达

转录因子AP-2α(activating protein 2α)在哺乳动物发育、分化以及肿瘤的发生等生命现象中起重要作用,最近的研究发现,在HaCaT角化细胞中,AP-2α可以影响vaseular endothelial growth factor(VEGF)的表达.对C 57BL/6J小鼠胸主动脉血管内皮细胞进行了原代培养,取2～4代细胞分别以转染质粒pCMV-Myc,pCMV-Myc-AP-2α,pCMV-Myc-VEGFA以及SiRNA-AP-2α,Control-RNAi-AP-2α,SiRNA-VEGFA,Control-RNAi-VEGFA.然后采用实时定量RT-PCR和Western Blot分别检测AP-2α和VEGF mRNA与蛋白的表达水平.结果发现在小鼠血管内皮细胞中AP-2α的过表达可使VEGF mRNA和蛋白质表达水平上升;培养细胞转染SiRNA-AP-2α后可使VEGF mRNA的表达和蛋白的表达水平下降;而VEGF的过表达及SiRNA-VEGFA对AP-2αmRNA和蛋白的表达水平没有明显影响,因此,在小鼠血管内皮细胞中AP-2α可上调VEGF的表达.

一种AP-2α选择性剪切的发现及其在MCF-7细胞中的功能研究

目的研究AP-2α的一种选择性剪切及其对MCF-7细胞生物学功能的影响。方法构建AP-2α基因表达质粒,得到pAP-2α和一个C-端编码产物完全不同于AP-2α的选择性剪切pAP-2αas表达质粒。通过荧光素酶法检测pAP-2αas和pAP-2α对含存活素(survivin)启动子核心序列的荧光素酶报告质粒pLuc-441活性影响的差异;并通过药物敏感性实验观察pAP-2αas和pAP-2α对乳腺癌细胞MCF-7药物敏感性影响的差异。结果采用荧光素酶法检测共转染pAP-2αas和pLuc-441的MCF-7细胞中survivin启动子活性,与对照pAP-2α相比,pAP-2αas也能抑制pLuc-441活性,但抑制的强度低于前者;药物敏感性实验显示,在MCF-7细胞中,转染pAP-2αas显著提高了药物敏感性,与pAP-2α产生的生物学功能近似。结论 AP-2αas作为一种体内的特异性剪切形式,具有和通常AP-2α相似但不完全相同的功能,推测这是基因表达调控的特殊方式,AP-2α对基因表达的调节在某些情况下可以不通过直接结合启动子发挥作用。

小鼠前脂肪细胞中AP-2α相互作用蛋白质的分离和鉴定

转录因子AP-2是一个功能重要的基因家族,AP-2α在协同调控脂肪细胞分化成熟,以及脂肪因子分泌的过程中发挥重要作用。为了阐明其协同调控的机制,本文采用anti-AP-2α抗体免疫共沉淀技术,从小鼠前脂肪细胞3T3-L1中分离AP-2α相互作用蛋白,然后用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱结合数据库查询鉴定AP-2α结合蛋白,找到了acyl-Coenzyme A dehydrogenase,long-chain、Protein-L-isoaspartate(D-aspartate)O-meth-yltransferase和T-complex proteom 1 subunit epsilon三个与AP-2α相互作用的蛋白。为进一步研究小鼠的前脂肪细胞中AP-2α蛋白聚集及在糖脂代谢调控中可能的作用机制提供了重要依据。

VIPR1启动子甲基化促进转录因子AP-2α下调VIPR1的表达并促进肝细胞癌的生长

目的探讨血管活性肠肽受体1(VIPR1)在肝细胞癌(HCC)组织中低表达的转录调控机制和生物学功能。方法肝癌细胞系Hep3B和Huh7常规培养,实验分为VIPR1启动子野生型组、启动子突变载体1组、启动子突变载体2组和启动子突变载体1+2组。双荧光素酶报告基因实验检测AP-2α表达对VIPR1启动子活性的影响;DNA甲基化转移酶抑制剂(DAC)处理肝癌细胞,焦磷酸测序法检测VIPR1启动子甲基化水平的变化;染色质免疫共沉淀检测AP-2α与VIPR1启动子的结合能力;Westernblot检测AP-2α的敲减作用以及VIPR1的表达;Westernblot检测两种细胞株中VIPR1的差异表达;qPCR和Westernblot检测VIPR1过表达和敲减效果;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;CCK8实验检测细胞增殖。建立裸鼠移植瘤模型,检测LV-NC组和LV-VIPR1组中肿瘤的体积和质量。结果与VIPR1启动子野生型组相比,启动子突变载体1+2与AP-2α表达质粒共转染后,荧光素酶活性明显恢复(P<0.05);DAC处理后,VIPR1启动子甲基化水平降低,并且随着甲基化程度减弱,与VIPR1启动子结合的AP-2α显著减少(P<0.01);敲减AP-2α后,VIPR1表达上升;Huh7细胞株中VIPR1表达低于Hep3B细胞株,在两种细胞株中成功构建了VIPR1过表达和敲减模型,VIPR1过表达增加了G2/M期的细胞数量(P<0.01),凋亡细胞显著增加(P<0.001),细胞增殖受到抑制(P<0.001),而VIPR1敲低则相反。体内实验表明VIPR1过表达组的肿瘤体积减小(P<0.001),肿瘤量降低(P<0.05)。结论HCC中VIPR1的启动子甲基化促进了转录因子AP-2α的结合,并且抑制了VIPR1表达,而VIPR1过表达可使细胞周期阻滞在G2/M期,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖和肿瘤生长。

转录因子AP-2α调控SOX9基因的表达

肝癌是肝脏中最常见的恶性肿瘤,是全球癌症相关死亡的第三大主要原因。肝癌发病具有隐蔽性、细胞异质性、耐药性的特点,且肿瘤易侵袭、转移和复发,使得其临床治疗效果欠佳。转录因子AP-2α在肝癌中作为肿瘤抑制因子发挥作用,其表达与肝癌患者的预后呈现正相关。SOX9在细胞分化、性别决定和肿瘤发生中起主要作用。在肝癌细胞中,SOX9异常增加可以促进癌细胞的生长。本研究利用JASPAR软件预测到SOX9的启动子区域含有潜在的AP-2α结合位点,通过萤光素酶和凝胶迁移试验(EMSA)证实了AP-2α可以与SOX9的启动子区域直接结合,抑制SOX9的转录活性。通过实时定量PCR和蛋白质免疫印迹发现,AP-2α抑制了SOX9的mRNA和蛋白质水平表达。这些结果提示了AP-2α可与癌基因SOX9的启动子区域结合,负调控肝癌细胞中SOX9的表达。

AP-2α、E-cadherin及β-catenin与早发型子痫前期的相关性

目的探讨AP-2α、E-cadherin及β-catenin在早发型子痫前期、晚发型子痫前期及34周前分娩的胎盘组织中的表达情况,从而研究其与早发型子痫前期发病机制的相关性。方法选取35例早发型子痫前期、30例晚发型子痫前期及10例34周前分娩的孕妇,采用免疫组化方法检测3组胎盘中AP-2α、E-cadherin及β-catenin的表达情况。结果早发型子痫前期、晚发型子痫前期及34周前分娩的孕妇胎盘组织比较,AP-2α及E-cadherin阳性表达率的差异有统计学意义(P<0.05),而β-catenin阳性表达率的差异无统计学意义(P>0.05)。结论早发型子痫前期与晚发型子痫前期可能存在不同的发病机制,且AP-2α及E-cadherin与早发型子痫前期发病机制有一定关系。

AP-2α抑制胃癌细胞BGC-823增殖并诱导凋亡的作用机制研究

目的研究核转录因子AP-2α抑制胃癌细胞株BGC-823增殖活性及诱导凋亡的作用和机制。方法收集临床胃癌及其癌旁组织标本30对,免疫印迹及荧光定量法检测AP-2α及Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)基因mRNA含量;生物软件预测AP-2α蛋白与KLF4基因启动子上的转录因子结合位点并进行验证。分别转染pc DH1-AP-2α及pshRNAKLF4到BGC-823细胞,转染后48 h,确定细胞转染效率,免疫印迹法检测胞内AP-2α、KLF4、P53及BCL-2蛋白表达;噻唑蓝(4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2-Htetrazolium bromide,MTT)检测基因干预后各组细胞增殖活性;流式法检测各组细胞凋亡情况。结果所有检测的30对组织标本中,肿瘤中AP-2α表达和KLF4基因mRNA含量均明显低于癌旁组织,差异有统计学意义(P <0. 01,vs癌旁);生物软件预测显示,AP-2α在KLF4基因启动子上存在9个碱基"5'-GCCGCCGGC-3'"的理论结合位点,位点位于转录起始位点前52碱基处,荧光素酶活性检测证实AP-2α可以结合于预测位点并对下游基因的转录进行正调控;细胞转染后48 h,GFP计数显示,细胞瞬时转染效率约为85%,免疫印迹检测数据表明,AP-2α过表达导致KLF4和P53蛋白表达上调,BCL-2蛋白表达下调,而KLF4基因沉默则能够明显减弱AP-2α对KLF4或者P53蛋白表达的影响;细胞转染后24～72 h,pc DH1-AP-2α转染能够明显抑制BGC-823细胞对数期增殖活性,pshRNA-KLF4转染则能够明显减弱AP-2α基因过表达对细胞增殖活性的抑制作用; pc DH1-AP-2α转染细胞后48 h,能够明显导致BGC-823细胞产生凋亡,pshRNA-KLF4转染则能够明显减弱AP-2α过表达产生的诱导细胞凋亡的能力。结论核转录因子AP-2α通过KLF4基因的转录调控对BGC-823细胞的增殖和凋亡产生影响。

转录因子AP-2α对人结肠癌细胞增殖的抑制作用及其机制

目的:研究转录因子活化蛋白-2α(transcription factor activator protein-2α,AP-2α)对人结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用及其相关机制。方法:构建pcDNA3.1(+)-AP-2α重组质粒,利用脂质体分别介导重组质粒pcDNA3.1(+)-AP-2α和空质粒pcDNA3.1(+)转染SW480细胞,以正常SW480细胞作为空白对照;采用RT-PCR和Western印迹法检测转染48h后各组细胞中AP-2α的表达水平;采用电泳迁移率分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测转染重组质粒后SW480细胞表达的AP-2α是否具有DNA结合活性;用MTT法研究AP-2α基因转染24、48、72h后SW480细胞的增殖情况;采用流式细胞术分析各组的细胞周期变化,Western印迹法检测细胞内p21/WAF1的表达水平。结果:转染pcDNA3.1(+)-AP-2α重组质粒48h后,SW480细胞内AP-2αmRNA含量以及蛋白水平均显著升高,并且具有较强的DNA结合活性;MTT结果提示,转染AP-2α基因后SW480细胞增殖趋缓;细胞周期分析结果提示,转染AP-2α基因48h后G0/G1期细胞比例较正常细胞增加(P<0.05);转染AP-2α基因48h后,SW480细胞内p21/WAF1表达增加。结论:AP-2α可抑制SW480细胞的增殖,其抑制作用很可能与激活p21/WAF1表达有关。

AP-2α、Bcl-2及C-myc在重度子痫前期患者胎盘组织中的表达及意义

目的探讨在重度子痫前期患者胎盘组织中转录因子激活蛋白-2α(AP-2α)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)及原癌基因(C-myc)的表达情况及临床意义。方法选取86例于2013年5月至2014年5月期间行剖宫产术分娩的产妇,分为正常对照组(n=43)与重度子痫前期组(n=43),应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫组化法检测两组产妇胎盘组织中AP-2α、Bcl-2和C-myc的表达。结果重度子痫前期组胎盘组织中AP-2α蛋白阳性表达显著高于对照组(P<0.05),C-myc、Bcl-2蛋白阳性表达均显著低于正常对照组(P<0.05);相较于对照组,重度子痫前期组中AP-2αmRNA表达明显升高,Bcl-2 mRNA和C-myc mRNA表达明显降低(P<0.05)。结论在重度子痫前期胎盘组织中C-myc、Bcl-2的表达下降,AP-2α表达上升,这种差异表达可能参与疾病的病理生理过程。