阴道毛滴虫重组蛋白AP33的免疫保护机制初探

目的探讨阴道毛滴虫重组AP33融合蛋白对宿主的保护性免疫机制。方法用纯化的重组AP33蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清和脾细胞多项免疫指标的变化;实验组与对照组分别用滴虫滋养体进行皮下和腹腔攻击,观察各组小鼠的行为变化和死亡时间。结果重组AP33蛋白免疫小鼠产生高效价抗体;实验组小鼠的CD4+T淋巴细胞有所增高(30.65±3.69)%,CD4+/CD8+比值明显升高(3.96±0.56)%(P<0.01);脾细胞培养上清液中mIL-2、mIFN-γ、mIL-4和mIL-6均有不同程度的升高,尤其mIFN-γ浓度增高最明显;皮下注射组,实验组小鼠背部出现明显溃疡;腹腔注射组,对照组小鼠6d内全部死亡,而实验组小鼠的存活时间比对照组长,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论重组AP33融合蛋白具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生较好的免疫保护作用,可能成为阴道毛滴虫预防或治疗性多价疫苗的侯选抗原。

阴道毛滴虫AP33基因克隆与序列分析

目的 :阴道毛滴虫黏附蛋白AP33基因的克隆与序列分析。方法 :提取阴道毛滴虫mRNA ,逆转录合成cDNA ,PCR得到阳性条带 ,将其克隆到pUCm T载体进行PCR、酶切及测序分析 ,并与GenBank中核苷酸序列进行同源性分析。结果 :阳性克隆经酶切鉴定 ,目的基因片段长度为 92 7bp。测序结果目的基因与阴道毛滴虫黏附蛋白AP33 1、阴道毛滴虫黏附蛋白AP33 3、阴道毛滴虫黏附蛋白AP33 2分别具 99%、97%和 94 %的同源性。结论 :成功克隆出阴道毛滴虫AP33基因序列 ,与已公布的AP33序列有很高的同源性。这为今后该蛋白的原核表达和大量制备提供一定的基础。

阴道毛滴虫ap33基因克隆及其表达载体的构建

目的 研究阴道毛滴虫粘附蛋白AP33的基因结构特点并构建其表达载体。方法 提取阴道毛滴虫mRNA,逆转录合成cDNA,PCR得到阳性克隆,将其亚克隆到pLICm-T载体中进行PCR、酶切及测序分析,并与CenBank中核苷酸序列进行同源性分析。再将亚克隆与表达载体分别酶切并连接。结果 阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为927bp,,ap33与国外已报道的3株T.vaginalis的ap33基因分别具99％、97％、94％的同源性。结论 成功克隆出阴道毛滴虫ap33基因序列,与已公布的ap33序列有很高的同源性。构建获得PET-32a(+)-ap33重组质粒,可在原核中进一步表达特异性蛋白。

阴道毛滴虫AP33基因的乳酸菌表达载体的构建

目的:构建阴道毛滴虫AP33基因的乳酸菌表达载体。方法:提取阴道毛滴虫总RNA为模板,经RT-PCR得到AP33基因的PCR特异性产物,将其连接入乳酸菌分泌表达载体pVE5523质粒中,并转化入TOP10菌中保存。结果 :构建的AP33-pVE5523重组表达载体,经PCR鉴定正确;获得的目的基因片段经测序与GenBank公布的阴道毛滴虫AP33基因序列100%符合。结论:成功构建AP33-pVE5523表达载体,为进一步研究阴道毛滴虫AP33基因在乳酸菌中的表达打下基础。

抗阴道毛滴虫AP33单克隆抗体的制备及其功能初探

目的制备阴道毛滴虫(T.υ317株)黏附蛋白抗原(AP33)单克隆抗体并初步分析鉴定其功能。方法将制备和纯化的融合黏附蛋白33(rAP33)为抗原,免疫BALB／c小鼠,共免疫3次(抗原含量分别为100、50和100μg),每次间隔2周,末次免疫后3 d取小鼠脾细胞及SP2／0骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG1500)作用下进行细胞融合,筛选出高滴度分泌的McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,蛋白质印迹(Western blotting)分析其特异性,间接免疫荧光实验(IFAT)进行定位,并初步探讨其体外对阴道毛滴虫黏附HeLa细胞的抑制作用。结果经筛选获得能稳定分泌抗AP33单克隆抗体的5株(4A2,4F11,4F8,4E7和4H11)杂交瘤细胞株,经免疫球蛋白类型和亚型鉴定为IgG1; ELISA和Western blotting分析显示,5株单抗均能与重组阴道毛滴虫AP33发生特异性结合;IFAT显示其中4株(4F11, 4F8,4E7,4H11)可识别培养的阴道毛滴虫,体外滴虫黏附抑制实验显示终浓度分别为200、200、400和200μg/ml,该4株单抗体外对滴虫黏附HeLa细胞的抑制率分别为50．08％,65．03％、50．70％和49．08％。结论制备的抗重组AP33单克隆抗体,体外对阴道毛滴虫黏附有较好的抑制功能。

阴道毛滴虫与人型支原体共生对AP33基因序列的影响

目的研究河南地区阴道毛滴虫临床分离株与人型支原体共生情况，并观察其共生对阴道毛滴虫AP33基因序列的影响。方法应用人型支原体及AP33基因的特异性引物对41株阴道毛滴虫临床分离株进行PCR扩增，扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，对AP33基因扩增产物测序，测序结果与GenBank已知序列比对，绘制进化树。结果有34株阴道毛滴虫扩增出人型支原体的特异性片段，大小为334bp；所有虫株均扩增出AP33基因特异性片段，碱基序列相似性为96．8％～99．3％，有多个位点发生突变。进化树分析提示人型支原体的共生对AP33基因序列有一定影响。结论河南地区阴道毛滴虫临床分离株与人型支原体共生具有普遍性，其共生对阴道毛滴虫的基因序列有一定影响。

重组阴道毛滴虫黏附蛋白33单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备重组阴道毛滴虫(T.υ)黏附蛋白33(AP33)单克隆抗体(McAb)并进行初步鉴定。方法将pET32(a)-AP33重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),用0.5 mmol/L IPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA法纯化,以纯化的融合蛋白33为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,免疫印迹分析其特异性。结果共筛选出能稳定分泌抗AP33单克隆抗体的5株(4A2,4F11,4F8,4E7,4H11)杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1;腹水的上清效价为1∶40 000-1∶80 000。免疫印迹分析显示,5株单抗均能与重组阴道毛滴虫AP33发生特异性结合;与阴道毛滴虫抗原分子量为33kDa抗原分子结合。结论制备的抗重组AP33杂交瘤细胞株能分泌识别重组AP33的高特异性单抗,为进一步研究其在阴道毛滴虫病免疫诊断中的应用奠定了基础。

快速诊断滴虫性阴道炎免疫层析试纸条的初步研制

目的用胶体金标记抗阴道毛滴虫重组AP33单克隆抗体制备金标AP33 mAb,研制开发出一种能快速、简便、有效检测阴道毛滴虫感染的免疫层析(GICA)试纸条。方法采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗阴道毛滴虫重组AP33单克隆抗体,选择最佳反应模式组装试纸条。用该试纸条检测滴虫性阴道炎患者及非滴虫性阴道炎患者白带中的靶抗原,鉴定方法的敏感性和特异性。结果用制备的免疫层析试纸条检测重组AP33抗原的最低量为20 ng/ml,其中以单克隆抗体4A2为包被抗体、单克隆抗体4F8为金标抗体的试纸条检测效果最佳。以湿片法为标准,用该试纸条检测60例滴虫性阴道炎患者白带,敏感性为90.0%(54/60);检测60例非滴虫性阴道炎患者白带,特异性为95.0%(57/60)。两法的总符合率为92.5%。结论GICA检测阴道毛滴虫特异性强、灵敏度高、简便快速,无需特殊仪器设备,有广泛应用价值。