APP695-siRNA慢病毒载体构建及其对SH-SY5Y细胞中APP695基因的沉默作用

目的:构建针对APP695的siRNA慢病毒载体,并检测其对人神经纤维母细胞瘤SH-SY5Y细胞株中APP695基因表达的沉默作用。方法:设计并合成针对筛选确定的APP695基因寡核苷酸序列特异性siRNA有效靶序列,同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列,将以上寡核苷酸序列退火后连入pFU-GW-iRNA质粒,酶切和测序鉴定后,将它们分别与包装质粒混合物共感染293T细胞,产生具有感染能力的慢病毒颗粒,并感染SH-SY5Y细胞,分未经病毒感染(CON)组、阴性对照病毒感染(NC)组和慢病毒介导阳性干扰(APP695-RNAi)组;应用实时荧光定量PCR(FQ-RT-PCR)检测各组细胞APP695mRNA的表达水平。结果:酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到pFU-GW-iRNA质粒;各质粒与包装质粒共感染293T细胞后收获慢病毒颗粒;感染SH-SY5Y细胞72h后,不同组别APP695mRNA表达水平不同(F=554.442,P<0.001),APP695-siRNA组表达水平低于CON组和NC组。结论:成功构建了APP695-siRNA慢病毒载体,该载体可有效沉默SH-SY5Y细胞中APP695mRNA的表达。

5-取代-1-氮杂蒽醌类衍生物A7对过氧化氢诱导转染人APP695基因的SH-SY5Y细胞应激损伤的保护作用

目的探究5-取代-1-氮杂蒽醌类衍生物A7对过氧化氢诱导转染人APP695基因的SH-SY5Y细胞(APPsw细胞)氧化应激损伤的保护作用。方法将APPsw细胞传代培养24 h后,加入不同浓度(0.01,0.1,1.0和10μmol·L^-1)的A7预处理24 h,再加入200μmol·L^-1过氧化氢(H 2 O 2)继续培养24 h,用MTT法检测细胞活性,用Hoechst染色法检测细胞凋亡,用Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率。结果5-取代-1-氮杂蒽醌类衍生物A7可剂量依赖性地增加过氧化氢处理后的细胞活力,经不同浓度的A7预处理后,加过氧化氢处理组的细胞活性明显低于对应单独A7处理组的细胞活性,但均高于单独过氧化氢处理组的细胞活性,差异具有统计学意义(P<0.05)。经不同浓度A7预处理后,加过氧化氢处理组与过氧化氢组比较细胞核中荧光显著变暗。过氧化氢组细胞早凋率为42.4%,A7(0.01,0.1,1.0和10μmol·L^-1)预处理24 h后加过氧化氢处理组细胞早凋率分别为22.7%,19.9%,16.4%和15.9%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论5-取代-1-氮杂蒽醌类衍生物A7对过氧化氢诱导APPsw细胞的氧化应激损伤具有保护作用,可抑制细胞凋亡。

突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建

目的构建携带突变型人淀粉样前体蛋白基因(APP695)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合载体。方法在NCBI上查找APP695的序列,设计引物。以pCB6质粒携带的野生型APP695序列为模板,以突变体引物扩增突变型APP695。将突变型APP695与pIRES2-EGFP连接并测序证实。结果经过酶切鉴定、PCR和DNA测序等方法,证实构建的pIRES2-EGFP/APP695突变型质粒载体序列正确。结论成功构建APP695-EGFP融合基因载体,为研究AD发病的分子机制和治疗时的药物筛选奠定基础。