侯氏黑散中风药、补虚药调控AQP-4、Cx43对脑缺血大鼠星形胶质细胞活化的影响

目的观察侯氏黑散方对脑缺血大鼠星形胶质细胞活化的影响,探讨其作用机制。方法将30只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、风药组(7.7 g/kg)、补虚药组(2.59 g/kg)和全方组(10.5 g/kg),每组6只。各给药组预先灌胃相应药液3 d,假手术组和模型组灌胃等体积生理盐水,第4日灌胃20 min后采用线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型,造模后每12 h给药1次,连续3 d。HE染色观察大鼠缺血侧脑组织病理变化,免疫荧光染色检测缺血侧侧脑室内囊胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、缝隙连接蛋白43(Cx43)表达,免疫组化染色检测缺血侧侧脑室内囊水通道蛋白-4(AQP-4)表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧脑组织大片坏死,血管管周间隙增大,缺血侧侧脑室内囊GFAP、Cx43、AQP-4表达明显升高(P<0.01);与模型组比较,风药组、补虚药组和全方组大鼠星形胶质细胞损伤明显减轻,风药组、全方组缺血侧侧脑室内囊GFAP、Cx43表达明显降低(P<0.01),各给药组缺血侧侧脑室内囊AQP-4表达明显降低(P<0.01)。结论侯氏黑散及风药拆方可通过调节GFAP、AQP-4及Cx43表达抑制脑缺血大鼠星形胶质细胞活化,减轻其超微结构损伤及水肿。补虚药可协同风药减少水内流,减轻水肿,符合侯氏黑散重用风药的组方思想。

黄芩苷抑制缺血性脑损伤大鼠脑组织TNF-α和AQP-4表达及减轻脑损伤的研究

目的研究黄芩苷对缺血性脑损伤大鼠抑制炎症反应、减轻脑损伤的作用机制。方法制备大鼠脑缺血损伤模型,随机分为对照组、模型组和黄芩苷治疗组,通过检测脑组织髓过氧物酶的含量,评价炎症反应的程度;通过检测脑组织伊文思蓝的含量,评价血脑屏障的破坏程度;通过ELISA法检测脑组织TNF-α的表达;通过Western blot法检测水通道蛋白-4(AQP-4)的表达变化。结果黄芩苷治疗组能明显减轻缺血性脑损伤大鼠脑组织炎症反应,减少脑梗死体积,以及降低脑组织TNF-α和AQP-4的表达水平。结论黄芩苷具有抑制缺血性脑损伤大鼠脑组织TNF-α和AQP-4的表达,减轻炎症反应和修复损伤的血脑屏障,对大鼠缺血性脑损伤有保护作用。

电针对颅脑损伤大鼠脑组织中AQP-4表达的影响

目的:对大鼠颅脑损伤后,于不同时间点开始介入电针治疗,观察其脑组织中AQP-4的表达和右侧前后肢回缩力变化与电针介入时间的关系,探索电针治疗颅脑损伤的最佳时间窗。方法:选用70只SD大鼠,随机分为空白组、模型对照组、电针治疗组(电针1组,电针2组),使用e CCI仪器在大鼠颅脑左侧开颅打击制备TBI(traumatic brain injury)模型。取大鼠"百会、关元",右侧前肢"曲池、合谷",右侧后肢"足三里、涌泉",电针1组于造模后4 h介入电针治疗,电针2组于第8天介入电针治疗,每组治疗各7 d。(1)造模后8 d、15 d和22 d分别测试并评价大鼠右侧前后肢肢体回缩力。(2)造模后8 d和15 d取大鼠创伤脑组织,一部分进行HE染色及免疫荧光染色,观察脑组织形态结构及脑组织中AQP-4蛋白的表达;一部分采用实时荧光定量PCR技术检测AQP-4mRNA的表达。结果:造模后8 d、15 d和22 d三个时间点电针1组前后肢肢体回缩力比电针2组、模型组恢复的好,比空白组稍差。光镜下,空白组脑组织形态结构正常;电针治疗组比模型组好,电针1组比电针2组好。脑组织中AQP-4蛋白的含量以及mRNA的表达,空白组、模型组、电针治疗组各组比较均有统计学差异(P<0.01),其中电针1组升高最明显。结论:电针治疗TBI早期介入效果更佳,其机制可能是通过提高脑组织中AQP-4的表达,减轻脑水肿,达到保护神经元的作用。

姜黄素预处理对大鼠脑缺血/再灌注损伤后AQP-4及脑水肿的影响

目的研究化学合成的姜黄素预处理对大鼠脑缺血/再灌注损伤后AQP-4及脑水肿的影响。方法采用线栓法阻塞大鼠大脑中动脉(MCAO),建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注实验模型,72只SD大鼠被随机分为假手术组(S组)、缺血/再灌注组(I组)和姜黄素(缺血前30 min腹腔给予50、100 mg.kg-1)组(C1和C2组),每组18只。I组和C1、C2组分别在脑缺血/再灌注后24 h处死。观察大鼠神经功能缺失的评分;干湿重法观察大鼠脑含水量的变化,通过收集透出脑血管外的伊文思蓝(EB)来示踪血脑屏障(BBB)的变化,免疫印记法检测AQP-4和c-Jun氨基端激酶(JNK)的表达情况。结果 S组无神经行为改变;C1、C2组脑含水量、EB量、AQP-4表达及JNK磷酸化水平与I组相比明显降低(P<0.05);C1、C2组神经学评分高于Ⅰ组(P<0.05)。结论化学合成的姜黄素可减轻大鼠局灶性脑缺血/再灌注后AQP-4表达水平及BBB的破坏程度,减轻脑水肿,其机制可能与抑制JNK通路的磷酸化激活有关。

神经调节素对大鼠脑缺血再灌注损伤AQP-4及GFAP表达的影响

应用线栓法经颈外-颈内动脉插线建立大脑中动脉闭塞再灌注(MCAO/R)大鼠动物模型,经颈内动脉单剂量注射1.5%神经调节素-1β(NRG-1β,0.3μg/kg)干预治疗。用干湿重法、免疫组化、免疫荧光双标记法和免疫印迹法观察NRG-1β对大鼠脑缺血再灌注损伤水通道蛋白(AQP-4)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。结果显示:随着缺血时间延长,对照组脑组织含水量逐渐增加,NRG-1β治疗能减少MCAO/R后脑组织含水量,与对照组相比,缺血1.5～2.0h组存在显著性差异(P<0.05)。脑缺血再灌注损伤可诱导脑组织AQP-4及GFAP表达,且随着缺血缺氧时间的延长,AQP-4及GFAP蛋白的表达逐渐增加。尽管它们均在胶质细胞中表达,但在脑组织中的分布略有不同。NRG-1β治疗可以增加二者在脑中的表达水平,与对照组相比具有显著性差异(P<0.01)。以上结果提示,NRG-1β可能通过激活内在的保护机制,增强胶质细胞的活性,从而抑制MCAO/R早期脑水肿的形成过程,改善神经元的生存环境,进而干扰脑缺血再灌注损伤的病理生理过程,对缺血性脑损伤具有积极的保护作用。

电针联合磁刺激治疗对脊髓损伤模型大鼠脊髓AQP-4、MCP-1的影响

目的观察脊髓损伤模型大鼠脊髓中AQP-4及MCP-1的变化,探讨电针及磁刺激治疗脊髓损伤的作用机制。方法 SD大鼠50只,随机分为正常组、模型组、电针组、磁刺激组和联合治疗组,用重物坠落打击方法制备脊髓损伤模型,采用免疫组化法观察大鼠脊髓中AQP-4、MCP-1阳性细胞数量。结果模型组中AQP-4、MCP-1含量明显高于其他组,联合治疗组中AQP-4、MCP-1阳性表达明显少于电针组及磁刺激组(P<0.01)。结论电针及磁刺激治疗均能显著降低脊髓损伤后AQP-4、MCP-1含量,减轻脊髓炎症水肿程度,在一定程度上阻止脊髓的继发性损伤,电针结合磁刺激治疗效果更好。

凉血通瘀方对大鼠脑出血脑组织含水量及AQP-4表达的影响

目的探讨凉血通瘀方对脑出血后脑水肿组织含水量及AQP-4表达的影响。方法采用自体尾状核内注射方法制备大鼠脑出血模型。大鼠分为凉血通瘀方治疗组、脑出血模型组和假手术组。凉血通瘀方治疗组采用凉血通瘀方灌胃,其余组采用生理盐水灌胃。分别观察脑出血后12 h、1 d、2 d、3 d、5 d神经功能缺损评分、脑组织含水量。免疫荧光法及聚合酶链反应监测脑水肿组织AQP-4蛋白、AQP-4 mRNA表达水平。结果凉血通瘀方治疗组和脑出血组在不同时间段内神经功能缺损均高于对照组,其脑组织含水量也高于对照组(P<0.05)。与脑出血组相比较,凉血通瘀方治疗组在脑出血后2、3、5 d时,AQP-4表达显著降低,在3、5 d后,大鼠AQP-4 mRNA表达显著降低。结论凉血通瘀方能够降低脑水肿组织AQP-4的表达,从而减轻脑水肿。

芳香开窍法对大鼠脑缺血再灌注后血脑屏障超微结构损伤及AQP-4表达的影响

目的通过观察大鼠脑缺血再灌注后血脑屏障(BBB)超微结构损伤及AQP-4表达情况,探讨芳香开窍法对BBB的保护作用。方法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,电镜下观察BBB超微结构,分别用RT-PCR方法、免疫组化方法研究AQP-4 mRNA、AQP-4蛋白表达的变化。结果与模型组比较,麝香配伍冰片组AQP-4 mRNA表达量显著降低(P<0.01),冰片组AQP-4 mRNA表达量也较模型组下降(P<0.05)。麝香配伍冰片组AQP-4 mRNA表达量较麝香组低,差异有统计学意义(P<0.05)。麝香配伍冰片组AQP-4蛋白表达量较模型组下降明显,差异有统计学意义(P<0.05),冰片组AQP-4蛋白表达量也较模型组下降(P<0.05)。结论麝香配伍冰片可减轻缺血再灌注后BBB超微结构损伤,抑制脑组织AQP-4 mRNA和蛋白的表达而起到脑保护作用,这可能是其芳香开窍的作用原理之一。

心脑通络液对MCAO大鼠脑水含量及AQP-4蛋白表达的影响

目的:研究心脑通络液对MCAO大鼠脑水含量及AQP-4蛋白表达的影响,探讨其对减轻缺血性脑损伤后脑水肿抑制机制,为心脑通络液的临床应用开发提供理论依据。方法:将健康SD大鼠随机分成5组。用线栓法制备MCAO大鼠模型,分别在造模成功后24h和7d实验。采用干湿比重法进行脑组织含水量测定;采用免疫组化法检测脑组织AQP-4蛋白表达。结果:心脑通络液能显著降低大鼠脑缺血后脑组织含水量,减轻缺血导致的脑组织水肿;心脑通络液各剂量组对缺血24h和7d脑组织中AQP-4蛋白表达有不同程度降低,尤以心脑通络液高剂量组表现最为明显。结论:心脑通络液能够显著降低脑组织含水量,减轻脑组织水肿;心脑通络液能通过抑制脑组织AQP-4蛋白表达,减轻脑水肿,保护血脑屏障,起到脑保护的作用。

头穴透刺对脑出血大鼠脑含水量及AQP-4表达研究

目的:探讨针刺对脑出血的调控机制。方法:96只大鼠随机分为3组(对照组、模型组、针刺组),每组分4个时间点(12 h、24 h、3天、7天),每个时间点8只大鼠,模型成功6 h后给予针刺百会透悬厘治疗,于12 h、24 h、3天、7天时间取材;然后测定脑含水量及评定AQP-4表达。结果:针刺有降低脑含水量作用,对AQP-4表达有抑制作用,针刺组优于其他两组(P<0.05)。结论:百会透刺悬厘治疗能降低脑含水量,控制脑水肿,促进脑出血恢复;抑制AQP-4表达,进而保护脑受损的神经元。

中枢神经系统炎性脱髓鞘患者血清AQP-4抗体与细胞因子的研究

目的研究中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病患者血清水通道蛋白(AQP-4)抗体、细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)及白细胞介素-4(IL-4)水平,以及AQP-4抗体与IFN-γ和IL-4间的相关性,探讨视神经脊髓炎(NMO)和多发性硬化(MS)的发病机制。方法入选患者共130例,其中NMO患者41例,MS患者59例,临床孤立综合征(CIS)患者15例,其他神经系统疾病患者15例。采用细胞转染的间接免疫荧光法检测患者血清AQP-4抗体滴度,ELISA法检测患者血清IFN-γ和IL-4水平,比较各组患者血清AQP-4抗体、IFN-γ和IL-4水平并分析AQP-4抗体与IFN-γ及IL-4的相关性。结果 NMO组血清AQP-4抗体滴度显著高于MS组、CIS组及其他疾病组(均P<0.05),而IFN-γ和IL-4水平与另3组比较差异无统计学意义(均P>0.05);MS组血清AQP-4抗体滴度与CIS组及其他疾病组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。NMO组血清AQP-4抗体滴度与IFN-γ和IL-4呈正相关(r分别为0.36、0.35,均P<0.05),MS组血清AQP-4抗体滴度与IFN-γ及IL-4无相关性(r分别为0.03、-0.10,均P>0.05)。结论血清AQP-4抗体可用于鉴别NMO和MS及其他炎性脱髓鞘病;NMO患者血清AQP-4抗体增高可能与细胞因子IFN-γ和IL-4有一定关系。

AQP-4和Ca^(2+)对脑出血后脑水肿作用的研究进展

脑水肿是脑出血后常见的病理过程,可分为细胞毒性脑水肿和血管源性脑水肿;脑水肿程度在脑出血继发性脑神经损伤的机制中占有非常重要的地位。AQP-4作为转运水及某些小分子物质的通道,可加重细胞毒性脑水肿,减轻血管源性脑水肿,其机制可能与AQP-4表达的空间特异性和时间依赖性有关。Ca2+作为细胞内第二信使,参与神经递质的合成与释放,其含量增高可加重脑水肿并使AQP-4表达上调,而AQP-4亦可作为信号通路对Ca2+起着调节作用。该文综述了近几年来AQP-4和Ca2+与脑出血后脑水肿关系的相关研究进展。

依达拉奉改善大鼠血脑屏障损伤的AQP-4机制研究

目的研究大鼠脑出血后血脑屏障（BBB）通透性与水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP-4）的关系及依达拉奉的干预作用。方法采用自体动脉血注入尾状核法制成大鼠脑出血模型，免疫组化法观察AQP-4的表达，伊文思蓝法测BBB的通透性，干湿重法计算脑含水量表示脑水肿。结果与对照组相比，模型组及依达拉奉组BBB通透性均在出血后6h开始升高，1～3d最高，依达拉奉组明显小于模型组（P〈0．01）。2组AQP-4也于6h开始升高，1～3d达到高峰依达拉奉组明显小于模型组（P〈0．05）。BBB通透性与AQP-4表达呈显著正相关（r=0．880，P％0．01），与脑水肿变化趋势一致。结论脑出血后产生的AQP-4增多，从而增加BBB通透性，参与脑水肿形成和发展，依达拉奉可抑制AQP-4的表达，从而有减轻脑水肿的作用。

AQP-4研究进展

AQP - 4是一种选择性水通透的内在膜蛋白 ,属于主体内在蛋白家族的成员 ,是目前哺乳动物组织中已被鉴定的十种水通道蛋白中的一种。大多数水通道蛋白活性可被汞抑制 ,而AQP - 4为汞不敏感水通道蛋白(MIWC) ,现已发现AQP - 4主要存在哺乳动物的脑组织中 ,而眼、肾、胃肠、肺组织等则表达较少。但在不同器官组织中 ,其作用及调节水转运机制不同。研究AQP - 4分子结构、生化、病理生理变化及水代谢障碍疾病的关系 ,对于指导临床水代谢障碍疾病如脑水肿。

水通道蛋白AQP-4与脑水肿

水通道蛋白(Aquaporin,AQP)是影响水分子跨膜转运和调节细胞内外环境平衡的膜蛋白,AQP-4是脑内表达最多的AQP亚型,主要分布在脑胶质细胞、室管膜上皮细胞、液体腔隙(如血管、蛛网膜下腔和脑室)的接触面及血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)两侧,在水分子通过BBB过程中发挥重要作用。各种原因引起的脑水肿,包括脑梗死、脑出血、脑肿瘤、脑外伤等,AQP-4的表达均发生改变,且与脑损伤、脑水肿发生发展过程密切相关。脑出血后血肿周围AQP-4表达的升高多伴随有BBB通透性的破坏、神经功能缺损、水肿程度的加剧,AQP-4表达水平降低则可以延缓或阻止脑水肿形成。基于AQP-4与脑水肿形成和消除的关系,AQP-4及AQP-4表达调节剂可为脑水肿治疗药物的开发提供新的思路。

健神利水方对脑出血大鼠水通道蛋白AQP-4表达的影响

目的:明确健神利水方对脑出血大鼠水通道蛋白-4(AQP-4)表达的影响。方法:实验大鼠分为空白组、假手术组、模型组、健神利水组,空白组不予任何处理,健神利水组和模型组采用胶原酶制作脑出血大鼠模型,假手术组以等量生理盐水代替胶原酶造模,模型组以生理盐水灌胃,健神利水组给予健神利水方灌胃,取相应时间点(6 h、24 h、3 d、7 d)的各组大鼠,断头取脑,根据脑组织干湿重测算脑组织水含量,并采用免疫印迹(Western blot)检测AQP-4表达水平,观察各组大鼠各个时间点AQP-4表达水平。结果:①空白组、假手术组未出现脑组织含水量变化,其余各组脑组织含水量从6h时起均逐渐增多;模型组和健神利水组于3 d时脑组织含水量达到顶峰。健神利水组6 h、24 h、3 d、7 d时间点脑组织含水量均低于模型组(P<0.05)。②空白组、假手术组未出现AQP-4上调,其余各组AQP-4从6 h时起均逐渐升高;模型组和健神利水组于3 d时AQP-4表达值达到顶峰。健神利水组6 h、24 h、3 d、7 d时间点AQP-4表达均低于模型组(P<0.05)。结论:健神利水方可以减少脑出血大鼠脑组织含水量,可抑制AQP-4表达。

实验性变态反应性脑脊髓炎AQP-4、CD4^+CD25^+调节性T细胞研究

目的:以髓鞘少突胶质细胞糖蛋白细胞外免疫球蛋白样结构域(MOGIgd)为抗原免疫C57BL/6小鼠,建立EAE模型,并检测AQP-4、CD4+CD25+T细胞的表达水平。方法:①采用分子克隆技术诱导表达MOGIgd-TrxA融合蛋白,纯化后以此融合蛋白为抗原于侧腹壁皮下多点注射免疫C57BL/6小鼠作为实验组(MOG组);同时以硫氧还蛋白(TrxA)、豚鼠脊髓匀浆(GPSCH)免疫小鼠分别作为阴性、阳性组。评估动物的临床神经功能、组织病理情况,评价模型的质量。②免疫组化法、荧光定量PCR技术测定AQP-4表达水平;经流式细胞仪(FACS)检测小鼠脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞。结果:①MOG组及GP-SCH组小鼠均呈慢性非缓解型病程,两组在发病时间、达峰时间、临床神经功能评分等方面差异无统计学意义(P>0.05)。TrxA组无一动物发病。模型组(包括MOG组和GPSCH组)动物HE染色可见血管周围炎性细胞浸润,胶质结节形成,髓鞘染色可见斑片状髓鞘脱失,大脑、小脑、脑干和脊髓均有不同程度受累。免疫组化定性和半定量分析显示MOG组和GPSCH组病灶周围炎症浸润处AQP-4表达与TrxA组相比明显增高(P<0.05);②MOG组CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞比例为(4.71±1.61)%,GPSCH组为(1.44±0.65)%,均明显低于TrxA组(P<0.01),且MOG组和GPSCH组之间的差异亦具有统计学意义(P<0.01)。结论:用MOGIgd免疫C57BL/6小鼠诱导EAE模型稳定,发病率高,为今后进一步研究MS的免疫发病机制和采取有效治疗措施打下基础。EAE模型动物AQP-4的表达量与炎症浸润的严重程度相关。

黄芪甲苷对TNF-α上调星形胶质细胞AQP-4基因表达的影响

目的探讨黄芪甲苷对TNF-α上调星形胶质细胞上AQP-4基因表达的影响。方法选用第2代第1天的星形胶质细胞。将星形胶质细胞接种到96孔板,分别用0、0.01、0.1、1、10和100ng·m L^(-1)的TNF-α和0、0.001、0.01和0.1μmol·m L^(-1)黄芪甲苷进行干预。用CCK-8试剂盒检测星形胶质细胞活性的变化,以筛选干预用TNF-α和黄芪甲苷的浓度。将星形胶质细胞分别用0、0.5、5、10、30和50ng·m L^(-1)的TNF-α进行干预,用RT-PCR方法检测AQP-4基因表达水平的变化,观察TNF-α对AQP-4基因表达水平的影响。将星形胶质细胞分为Sham组、TNF-α组、0.001μmol·m L^(-1)ASIV+TNF-α组、0.01μmol·m L^(-1)ASIV+TNF-α组、0.1μmol·m L^(-1)ASIV+TNF-α组,用RT-PCR方法检测AQP-4基因表达水平的变化,观察黄芪甲苷对TNF-α诱导星形胶质细胞AQP-4基因表达的影响。结果当TNF-α的浓度为0.01、0.1、1、10ng·m L^(-1)时,星形胶质细胞的活性与0ng·m L^(-1)相比差异无统计学意义(P<0.05);当TNF-α的浓度为100ng·m L^(-1)时,星形胶质细胞的活性与0ng·m L^(-1)相比明显下降(P<0.05)。当黄芪甲苷的浓度为0.001、0.01、0.1μmol·m L^(-1)时,星形胶质细胞的活性与0μmol·m L^(-1)相比均有提高(P<0.05)。与0ng·m L^(-1)组相比,各TNF-α干预组的AQP-4基因表达水平均升高(P<0.05),以10ng·m L^(-1)TNF-α干预组的作用最明显。0.001、0.01、0.1μmol·m L^(-1)黄芪甲苷+TNF-α三个干预组的AQP-4基因表达水平与TNF-α干预组相比明显降低(P<0.05)。结论当TNF-α的浓度在0~100ng·m L^(-1)之间时对星形胶质细胞无明显细胞毒性;所选浓度范围的黄芪甲苷可促进星形胶质细胞细胞增殖;TNF-α诱导AQP-4的基因表达具有浓度依赖性;黄芪甲苷可下调由TNF-α所致的星形胶质细胞上AQP-4基因表达水平的升高。

视神经脊髓炎AQP-4抗体与磁共振病灶及诱发电位的关系研究

目的研究视神经脊髓炎患者血清水通道蛋白抗体与头、脊髓磁共振病灶及诱发电位的关系。方法选取确诊的视神经脊髓炎患者56例,回顾性分析其血清水通道蛋白抗体、头及脊髓磁共振病灶、诱发电位的特点,分为AQP-4抗体阳性组及AQP-4抗体阴性组,分析水通道蛋白抗体与头、脊髓磁共振病灶及诱发电位的相关性。结果 AQP-4抗体阳性组及AQP-4抗体阴性组在头、脊髓磁共振及诱发电位方面差异有统计学意义(P<0.05)。结论视神经脊髓炎患者血清AQP-4抗体与头、脊髓磁共振病灶及诱发电位具有相关性。