Gab2通过PI3K/Akt/ARK5/MMP途径影响乳腺癌的侵袭和转移

目的探讨Gab2在乳腺浸润性导管癌侵袭和转移中的分子机制,为临床预防乳腺癌的侵袭和转移提供理论依据。方法采用免疫组织化学SP法检测80例乳腺浸润性导管癌组织及癌旁相对正常组织(>5 cm)中Gab2蛋白表达情况,并分析其表达与乳腺浸润性导管癌临床病理参数的相关性,分析浸润性导管癌中Gab2、MMP-2及MMP-9蛋白表达的相关性。采用Western blot检测乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231中Gab2蛋白的表达情况。采用RNAi技术将小RNA干扰质粒瞬时转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,应用Western blot检测转染成功后各组细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达情况,应用Transwell体外侵袭实验检测各组细胞的侵袭性,用EGF刺激细胞后Western blot检测Akt及ARK5的磷酸化情况。结果浸润性导管癌组织中Gab2蛋白的阳性表达率明显高于癌旁正常组织(P<0.01),浸润性导管癌中Gab2蛋白的表达与ER、组织学分期及淋巴结转移密切相关(P<0.05),且其表达与MMP-2及MMP-9蛋白的表达呈正相关;MDA-MB-231细胞系中Gab2蛋白表达量高于MCF-7细胞系中表达量;转染干扰质粒24 h后,与转染空载细胞组相比,SiG ab2/MDA-MB-231细胞组中Gab2蛋白的表达量明显降低,结果显示转染成功。同时,SiG ab2/MDA-MB-231细胞组穿过Transwell小室人工基膜数量明显减少(P<0.05),并伴有MMP-2、MMP-9蛋白表达降低(P<0.05)。用EGF刺激各组细胞,结果显示:在SiG ab2/MDAMB-231细胞组Akt及ARK5的磷酸化明显受到抑制。结论Gab2通过PI3K/Akt/ARK5信号通路影响MMP-2、MMP-9的表达从而促进乳腺癌的侵袭与转移。

ARK5与乳腺癌侵袭转移关系的研究

目的探讨ARK5在乳腺癌侵袭和转移中的意义。方法采用免疫组化SP法检测58例乳腺癌组织和15例癌旁乳腺组织中MMP-2、MMP-9及ARK5表达。应用小RNA干扰技术,将合成的小RNA干扰质粒转染MDA-MB-435细胞株,采用Western blot法检测瞬时转染后ARK5蛋白表达情况。通过体外侵袭实验检测细胞转染后侵袭能力的变化。ARK5下降后,再次进行Western blot法检测MMP-2、MMP-9蛋白表达。结果乳腺癌组织中MMP-2、MMP-9和ARK5免疫组化阳性结果之间存在正相关性。转染后的细胞株命名:转染ARK5质粒的MDA-MB-435细胞称之为SiARK5/MDA-MB-435,转染对照质粒的MDA-MB-435细胞称之为Scr/MDA-MB-435。转染72 h后,与Scr/MDA-MB-435细胞相比,SiARK5/MDA-MB-435细胞的ARK5蛋白表达水平降低。ARK5表达降低的乳腺癌细胞侵袭并穿透Matrivgel膜基质的细胞数量比对照组少(P<0.01),且MMP-2、MMP-9蛋白表达量降低。结论应用小RNA干扰技术降低ARK5蛋白的表达使MDA-MB-435细胞侵袭转移能力降低,同时MMP-2、MMP-9蛋白表达降低,提示ARK5通过MMP-2、MMP-9在乳腺癌侵袭转移中发挥重要作用。

ARK5、MMP-2和MMP-9在胃癌中的表达及与侵袭转移的关系

目的:探讨ARK5、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)在胃癌组织中的表达及与胃癌侵袭转移的关系。方法:免疫组织化学方法检测66例胃癌组织及20例正常胃组织中ARK5、MMP-2、MMP-9的表达;脂质体介导法将ARK5-siRNA转染入胃癌细胞株SGC-7901(siARK5/SGC7901细胞组),以SCRsiRNA转染组(scr/SGC7901细胞组)作为对照组,Western blot检测转染后ARK5、MMP-2、MMP-9蛋白表达;Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭能力。结果:ARK5、MMP-2、MMP-9在胃癌组织中的阳性表达率分别为68%、76%、68%,三者之间差异具有统计学意义(P<0.05);ARK5的表达与胃癌的浸润深度、细胞分化程度、TNM分期及淋巴结转移呈正相关(P<0.05),与年龄、性别、肿瘤大小无关(P>0.05);转染后siARK5/SGC7901细胞组表达ARK5、MMP-2和MMP-9蛋白水平降低,体外侵袭能力明显降低(P<0.05)。结论:ARK5、MMP-2和MMP-9在组织中的表达有相关性,ARK5与胃癌的侵袭和转移密切相关,可作为判断预后的指标和化学治疗的靶点。

Gab2-Akt-ARK5通路在胶质瘤侵袭中的研究

目的:探讨Gab2-Akt-ARK5通路在胶质瘤侵袭中的意义。方法:采用免疫组织化学SP法检测90例胶质瘤组织中ARK5及Gab2表达。采用小RNA干扰转染LN-229细胞株,Western Blot检测瞬时转染后ARK5及Gab2表达。体外侵袭实验检测转染后侵袭能力变化及Western Blot检测Gab2下降后Akt和ARK5的磷酸化。结果:胶质瘤组织中ARK5和Gab2免疫组织化学阳性结果呈正相关且在高级别胶质瘤(WHO分级为Ⅲ、Ⅳ级)中表达明显高于低级别胶质瘤(WHO分级为Ⅰ、Ⅱ级)。转染ARK5、Gab2、ARK5-Gab2及SCR质粒的LN-229细胞分别称siARK5/LN-229、siGab2/LN-229、siARK5-siGab2/LN-229和SCR/LN-229。其中siARK5干扰效率为70%,siGab2的干扰效率为75%。转染后,与SCR/LN-229相比,siARK5/LN-229中ARK5表达降低,siGab2/LN-229中Gab2表达降低,siARK5-siGab2/LN-229中ARK5和Gab2表达均降低。siARK5/LN-229和siGab2/LN-229侵袭并穿透Matrigel膜基质的细胞数均比对照组少(P<0.01),且siARK5-siGab2/LN-229细胞数减少更显著(P<0.01)。在IGF-1刺激下,siGab2/LN-229中Akt和ARK5的磷酸化减弱。结论:应用小RNA干扰技术降低ARK5或Gab2表达使LN-229细胞侵袭转移能力降低,同时Gab2表达降低抑制ARK5和Akt磷酸化,提示Gab2-Akt-ARK5通路参与胶质瘤细胞的侵袭。

Akt1和ARK5在乳腺癌中的表达及临床病理意义

目的探讨Akt1和ARK5在乳腺癌组织中表达与临床病理意义。方法回顾性分析88例乳腺癌临床病理资料,将其肿瘤组织制成组织芯片,并用免疫组化En Vision两步法检测Akt1和ARK5在乳腺癌组织中的表达,取10例癌旁组织作对照。结果88例乳腺癌中Akt1阳性表达率是77.3%(68/88),乳腺癌中Akt1表达与淋巴结转移、TNM分期密切相关(P<0.05)。ARK5阳性表达率是48.9%(43/88),乳腺癌中ARK5表达与淋巴结转移、肿瘤直径密切相关(P<0.05)。此外,88例乳腺癌中Akt1和ARK5阳性表达呈现正相关(r=0.343,P<0.05)。结论乳腺癌中Akt1和ARK5的表达水平与临床病理特征密切相关,有望作为评估乳腺癌的临床病理分期的重要指标。

ARK5与肿瘤侵袭转移相关性的研究进展

ARK5(AMPK-related protein kinase 5,又称NUAK1)是AMPK(AMP-activated protein kinase)的亚家族成员之一,其是Akt的下游信号分子。ARK5在各种肿瘤细胞系中表达,有研究表明ARK5能促进肿瘤的发生和抑制肿瘤细胞的凋亡,且Akt-ARK5通路与肿瘤的恶性发展密切相关。该文对ARK5在肿瘤侵袭和转移中的作用,及其与肿瘤侵袭相关的信号分子的相互关系进行综述。

ARK5蛋白在上皮性卵巢癌细胞卡铂耐药中的作用

目的:探索上皮性卵巢癌细胞卡铂耐药的机制,以提高卵巢癌患者化疗的疗效。方法:应用CCK8法检测卡铂处理后的上皮性卵巢癌细胞增殖,Western blot法检测上皮间质化转变相关蛋白E-Cadherin和Vimentin表达情况,流式细胞技术检测细胞表面CD133的变化情况,使用si RNA敲降AMP激活的蛋白激酶家族成员5(ARK5)后再观察卡铂的作用。结果:上皮性卵巢癌细胞系SKOV3与A2780的卡铂IC50分别为2.824 μg/m L 与1.760 μg/m L,并且卡铂能诱导上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质化转变;卡铂诱导ARK5显著上调,而不影响SNF1/AMP激活的蛋白激酶表达,敲降ARK5基因能显著减弱卡铂诱导卵巢癌细胞产生上皮间质化转变的效果。结论:ARK5在上皮性卵巢癌细胞卡铂耐药机制中具有重要作用,降低ARK5的表达可以减弱卡铂诱导卵巢癌细胞上皮间质化转变的作用。

ARK5、MMP-2和MMP-9在胃癌中的表达及与侵袭转移的关系

目的对ARK5、MMP-2、MMP-9在胃癌组织中的表达进行探讨,同时探讨其与胃癌侵袭转移的关系。方法在医学院病理学教研室中选取110例胃癌组织石蜡标本,作为观察组,再选取110例正常胃黏膜组织作为对照组。使用免疫组织化学方法和脂质体介导法对ARK5、MMP-2、MMP-9在正常胃组织和胃癌组织中的表达进行检测,并对胃癌细胞株SGC-7901转染入ARK5-siRNA,使用Western blot来对转染之后的ARK5、MMP-2和MMP-9的蛋白表达进行检测。细胞体外侵袭的能力主要通过Transwell侵袭实验来进行检测。结果在胃癌组织中,ARK5的阳性表达率为68.1%,MMP-2的阳性率表达为76.3%,MMP-9的阳性表达率为69.0%,差异具有统计学意义(P<0.05)。其中ARK5的表达主要与患者的淋巴结转移、TNM分期、细胞分化程度和胃癌浸润程度有关(P<0.05)。转染之后体外侵袭能力有所降低,细胞组对ARK5、MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平有所降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论在组织中ARK5、MMP-2、MMP-9的表达具有相关性,而且ARK5和侵袭转移具有比较密切的关系。因此在胃癌的预后指标判断和化学治疗中可以将ARK5作为一个治疗靶点和判断指标。

siRNA干扰降低ARK5或Gab2表达对LN-229细胞侵袭的影响及作用机制

目的探讨siRNA干扰降低ARK5或Gab2表达对LN-229细胞侵袭的影响及作用机制。方法采用小RNA干扰技术转染LN-229细胞株,并用Western blot分别检测转染前和瞬时转染后ARK5和Gab2蛋白表达。通过体外侵袭实验检测转染后侵袭能力的变化。ARK5或Gab2下降后明胶酶谱分别检测MMP-2和MMP-9蛋白表达。结果 转染ARK5,Gab2及SCR质粒的LN-229细胞分别称SiARK5/LN-229,SiGab2/LN-229和SCR/LN-229。转染后,与SCR/LN-229及LN-229相比,SiARK5/LN-229中ARK5蛋白表达降低,SiGab2/LN-229中Gab2蛋白表达降低。ARK5或Gab2降低的LN-229细胞侵袭并穿透Matrigel膜基质的细胞数量均比SCR/LN-229少(P<0.01)。与SCR/LN-229细胞相比,SiARK5/LN-229和SiGab2/LN-229中MMP-2,MMP-9蛋白表达均降低。结论 应用小RNA干扰技术降低ARK5或Gab2的表达使LN-229细胞侵袭力降低,同时MMP-2和MMP-9表达降低,提示ARK5和Gab2表达降低可通过调节MMP-2和MMP-9的表达影响LN-229细胞的侵袭。

ARK5在肝癌组织中的表达及其对肝癌SMMC-7721细胞生长的影响

目的:检测ARK5在肝癌组织及肝癌SMMC-7721细胞中表达水平,探讨其对肝癌细胞生长的作用。方法:采用PCR和Western blotting法检测30例肝癌组织及癌旁组织、正常肝细胞LO2及肝癌SMMC-7721细胞中ARK5 mRNA和蛋白表达水平;合成ARK5的小干扰RNA(siRNA)和阴性对照siRNA,转染至SMMC-7721细胞分别为实验组和阴性对照组,同时设空白对照组,采用MTT法和流式细胞术检测各组肝癌细胞的增殖活性和细胞凋亡率。结果:PCR和Western blotting法检测,肝癌组织和肝癌SMMC-7721细胞中ARK5mRNA和蛋白表达水平明显高于癌旁组织和LO2细胞(P<0.05)。MTT法检测,实验组24、48和72h细胞生长抑制率分别为(19.39±5.42)%、(23.19±0.53)%和(20.74±1.23)%,均高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01);流式细胞术检测,实验组细胞凋亡率为(15.017±0.945)%,与空白对照组[(8.770±0.656)%]和阴性对照组[(8.763±1.201)%]比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:ARK5在肝癌组织和肝癌SMMC-7721细胞中表达水平明显升高,抑制其表达可抑制肝癌细胞生长,促进肝癌细胞凋亡,提示ARK5可能作为一种癌基因促进肝癌的形成。

miR-145-5p靶向ARK5调控人上皮性卵巢癌细胞增殖凋亡的作用

目的探讨miR-145-5p对人上皮性卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响及可能涉及的分子机制。方法实时定量PCR检测miR-145-5p在正常卵巢上皮细胞及卵巢癌细胞中的表达差异,CCK-8、流式细胞术检测过表达miR-145-5p对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响。靶基因预测软件预测miR-145-5p的靶基因,生物信息学、Western blot、双荧光素酶基因验证报告实验、挽救实验等方法预测并验证miR-145-5p在卵巢癌细胞中发挥作用涉及的分子机制。结果卵巢癌细胞中miR-145-5p的表达水平明显低于正常卵巢上皮细胞(t=4.345,P=0.049)。与对照组相比,过表达miR-145-5p的卵巢癌细胞增殖率明显降低(t=-15.790,P<0.001),凋亡率明显增加(t=5.433,P=0.032)。TargetScan软件在线预测及双荧光素酶基因验证报告实验结果表明,ARK5是miR-145-5p的直接靶基因(t=4.583,P=0.010)。ARK5过表达细胞的增殖率明显升高(t=27.290,P<0.001),凋亡率明显下降(t=-8.241,P=0.001)。过表达miR-145-5p可在mRNA(t=-12.824,P<0.001)及蛋白水平(t=-4.792,P=0.001)明显下调ARK5的表达。ARK5的挽救性表达显著抵消了miR-145-5p对细胞增殖的抑制(t=15.580,P=0.004)和促细胞凋亡(t=-12.470,P=0.006)的效果。结论miR-145-5p可能是通过靶向抑制ARK5来抑制卵巢癌细胞增殖和促进细胞凋亡的。

ARK5和MMP-2在人脑胶质瘤中的表达及其临床意义

目的探讨腺苷酸活化蛋白激酶5(ARK5)与基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在人脑胶质瘤中的表达,并探讨两者的相关性及其临床意义。方法收集具有明确病理分级的67例新鲜人脑胶质瘤标本(实验组,A组),其中低级别级胶质瘤(Ⅰ～Ⅱ级)28例(A1组,n=28),高级别胶质瘤(Ⅲ～Ⅳ级)39例(A2,n=39),并收集32例脑外伤行内减压去除的脑组织标本作为对照组(B,n=32)。分别采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)与Westernblot测定标本中ARK5和MMP-2的mRNA及蛋白表达水平,研究ARK5和MMP-2在胶质瘤中的表达水平及与病理分级的关系。结果 (1)胶质瘤组ARK5和MMP-2 mRNA及蛋白表达水平较对照组显著上调(P<0.05)。(2)A2组ARK5和MMP-2 mRNA及蛋白表达水平较A1组显著上调(P<0.05)。(3)MMP-2在胶质瘤中的表达与ARK5呈显著正相关(r=0.782,P<0.01)。结论 ARK5和MMP-2在人脑胶质瘤中呈高表达,且它们的表达与胶质瘤的病理分级相关,可能与人脑胶质瘤的增殖及侵袭有关。

siRNA沉默ARK5基因对SMMC-7721细胞侵袭及MMP-2蛋白分泌的影响

目的:观察siRNA沉默ARK5基因的表达对肝癌SMMC-7721细胞侵袭及MMP-2蛋白分泌的影响。方法:采用qRT-PCR和Western blot法检测SMMC-7721细胞和正常肝细胞LO2中ARK5的表达。体外合成靶向ARK5基因的siRNA,转染肝癌SMMC-7721细胞,并设阴性对照和空白对照,采用Western blot方法检测3组细胞中ARK5蛋白的表达,通过Transwell小室模型检测细胞的体外侵袭能力,采用ELISA法检测细胞培养基中MMP-2蛋白的含量。结果:SMMC-7721细胞中ARK5 mRNA和蛋白的表达水平高于LO2细胞(P<0.05);沉默ARK5基因后,SMMC-7721细胞的侵袭受到抑制,且MMP-2蛋白的分泌水平低于阴性对照和空白对照(P<0.05)。结论:沉默ARK5基因可能通过MMP-2途径抑制SMMC-7721细胞的侵袭。

稳定表达siRNA-ARK5基因的胃癌SGC-7901细胞系的构建

目的构建稳定表达siRNA-ARK5基因的人胃癌SGC-7901细胞系,为研究ARK5在胃癌发生发展中的作用与机制奠定基础。方法把pGCsilencerU6/GFP/Neo-RNAi-ARK5重组质粒通过脂质体转染胃癌SGC-7901细胞,利用不同浓度的G418筛选获得稳定转染细胞株,挑取单克隆细胞系进行培养,应用荧光显微镜和RT-PCR技术确定是否获得了ARK5基因被稳定抑制的单克隆细胞系。结果成功挑取的4株单克隆细胞中2株细胞的ARK5基因的表达被显著抑制。结论通过siRNA干扰技术成功构建了稳定表达siRNA-ARK5基因的胃癌SGC-7901细胞系,为研究ARK5在胃癌发生发展中的作用与机制奠定了基础。

LKB1 VEGFR2 ARK5在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的：探讨LKB1、VEGFR2、ARK5在人非小细胞肺癌（NSCLC）发生、发展中的作用。方法应用免疫组化S-P法检测LKB1、VEGFR2、ARK5在50例非小细胞肺癌标本和10例癌旁正常肺组织标本中的表达。结果 LKB1在癌旁正常肺组织中的阳性表达率明显高于NSCLC组织（P〈0.05）；VEGFR2、ARK5在NSCLC组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常肺组织（P〈0.05）。LKB1、VEGFR2、ARK5在NSCLC组织中的表达与患者的年龄、性别、组织学类型无关（P＆gt;0.05）；与临床分期存在相关性（P〈0.05），与淋巴结转移有相关性（P〈0.05）；在组织学分级中，NSCLC高分化组与低分化组比较，三者阳性表达率均有显著性差异（P〈0.05）。结论 LKB1、VEGFR2、ARK5均在NSCLC中表达，与NSCLC临床病理特征密切相关，共同参与NSCLC的发生发展。

不同类型和分期的肺癌粘附、转移能力与肿瘤细胞ARK5，Integrinβ1，MMP9表达高低的关系

目的通过对不同类型和分期肺癌组织中腺苷酸活化蛋白激酶5（ARK5），Integrinβ1和MMP93种细胞因子表达高低的检测，探讨其与肺癌粘附、转移能力的关系。方法采用免疫纽化S-P法检测52例癌旁正常肺组织和肺癌组织ARK5，Integrinβ1和MMP9的表达。结果肺癌组织ARK5，Integrinβ1和MMP9表达显著高于癌旁正常肺组织（P〈0．01）。鳞癌与腺癌、大、小细胞癌中ARK5，Integrinβ1和MMP9的表达分别比较均P〈0．05，而腺癌、大、小细胞癌三者之间相比无统计学差异。低分化癌ARK5，Integrinβ1和MMP9表达均高于高、中分化癌（P〈0．05），而高、中分化癌之间相比无统计学差异。肺癌伴有淋巴结及远处浸润转移者ARK5，Integrinβ1和MMP9表达均高于无淋巴结及远处浸润转移者（P〈0．05），同时在Ⅲ期和Ⅳ期中这3种细胞因子表达均高于I期和Ⅱ期（P〈0．05）。结论ARK5，Integrinβ1和MMP9的表达在腺癌、大细胞癌、小细胞癌中增高，尤其在低分化及伴有淋巴结及远处浸润转移者中明显增高，但在鳞癌中增高不明显，提示这3种细胞因子的高表达与低分化腺癌、大细胞癌、小细胞癌粘附、转移的能力呈正相关。

miR-424通过结合ARK5 mRNA 3'-UTR抑制胶质瘤细胞侵袭

前期的研究证明,人腺苷酸活化蛋白激酶5(ARK5)通过Gab2-Akt-ARK5通路,促进胶质瘤的侵袭。然而,ARK5的调节机制尚不清楚。本研究旨在探讨miR-424是否通过与ARK5 mRNA结合,进而影响胶质瘤侵袭。通过Targetscan找到与ARK5的3'-UTR区互补结合的microRNA(miR-424)。运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同胶质瘤细胞系中miR-424表达水平,发现3种胶质瘤母细胞(高级别胶质瘤细胞)株中,miR-424表达量均不同程度低于低级别胶质瘤H4细胞株。miR-424及miR-424抑制剂质粒转染胶质瘤细胞系H4、LN-229并结合蛋白质印迹法显示,miR-424可负向调控ARK5蛋白表达。qRT-PCR显示,在胶质瘤细胞内过表达miR-424后,ARK5mRNA无显著变化,提示miR-424在翻译水平影响ARK5蛋白表达。Transwell侵袭实验显示,过表达miR-424导致胶质瘤细胞体外侵袭能力明显减弱。双荧光素酶基因报告检测显示,miR-424能与ARK5 mRNA的3'-UTR结合,抑制荧光素酶活性。上述结果提示,miR-424可以结合ARK5mRNA的3'-UTR而抑制ARK5蛋白翻译,从而抑制胶质瘤细胞侵袭。

胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞ARK5表达与吉西他滨化疗疗效及预后的相关性

目的检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞(CTCs)ARK5的表达,探讨其与胰腺癌患者吉西他滨化疗疗效及预后的相关性。方法收集2016年1月至2021年6月嘉兴学院附属第二医院肝胆外科收治的175例胰腺癌患者外周血标本。运用纳米微流控芯片技术富集CTCs,采用免疫荧光法检测CTCs ARK5的表达。依据ARK5表达情况分为阳性组和阴性组,比较两组患者临床资料、吉西他滨化疗疗效、中位生存期和无进展生存期的差异。结果175例患者中98例(55.6%)富集到CTCs,其中ARK5阳性组70例,阴性组28例,两组患者临床资料的差异均无统计学意义,具有可比性。70例ARK5阳性组患者中64例(91.4%)对吉西他滨产生了耐药性,28例ARK5阴性组患者中12例(42.8%)对吉西他滨产生耐药性,ARK5阳性组吉西他滨耐药发生率显著高于阴性组,差异有统计学意义(P<0.001)。ARK5阳性组患者中位生存期为11.5个月,阴性组为14个月;ARK5阳性组无进展生存期为6个月,阴性组为8个月,ARK5阳性组生存期显著短于阴性组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论CTCs ARK5阳性表达的胰腺癌患者对吉西他滨化疗耐药发生率显著高于阴性患者,生存时间显著低于阴性患者,检测CTCs的ARK5表达有可能作为判断胰腺癌患者化疗疗效及预后的一种新方法。

siRNA干扰ARK5蛋白表达对U251细胞侵袭潜能影响机制探讨

目的:探讨siRNA干扰降低腺苷酸活化蛋白激酶5(AMPK-related protein kinase 5,ARK5)表达对U251细胞侵袭潜能的影响及其机制。方法:采用蛋白质印迹法检测U251细胞中ARK5表达。应用siRNA干扰技术转染U251细胞株,并采用蛋白质印迹法检测瞬时转染后ARK5蛋白表达情况。通过体外侵袭实验检测细胞转染后侵袭能力的变化。ARK5下降后,蛋白质印迹法检测间质细胞来源的YKL-40、N-cadherin、Vimentin蛋白和调节因子Snail、Slug、Twist1和Zeb1的表达。结果:转染ARK5质粒的U251细胞ARK5表达下降。ARK5表达降低的U251细胞侵袭并穿透Matrigel膜基质的细胞数量为22,U251对照组为41,SCR/U251对照组为42,两两比较,ARK5表达降低的实验组透膜数比两对照组少(P<0.001),同时蛋白质印迹法结果显示,YKL-40、N-cadherin和Vimentin蛋白表达量降低,与间质转化相关的转录因子仅Snail的表达降低,而转录因子Slug、Twist1和Zeb1表达无明显改变。结论:应用siRNA干扰技术降低ARK5蛋白的表达使U251细胞侵袭转移能力降低,同时YKL-40、N-cadherin和Vimentin蛋白和转录因子Snail的表达量降低,提示ARK5蛋白表达降低可通过调节间质转化影响U251细胞的侵袭。

miR-424-5p靶向ARK5逆转胃癌耐药细胞对顺铂的耐药性的影响及机制研究

目的探讨miR-424-5p对胃癌细胞顺铂(cisplatin,DDP)耐药的影响及其作用机制。方法利用RT-qPCR检测胃癌DDP耐药细胞(SGC7901/DDP)及其亲代细胞(SGC7901)中miR-424-5p及ARK5的表达水平;利用Lipofectamine 2000将miR-424-5p mimic、siR-ARK5、miR-424-5p mimic+pcDNA-ARK5转染至SGC7901/DDP中,通过MTT法测定各转染组SGC7901/DDP细胞对DDP耐药性的影响;以Target Scan预测miR-424-5p的潜在靶基因,采用双荧光素酶试验进行验证;利用免疫印迹(western blot,WB)试验测定转染后ARK5蛋白的表达水平。结果胃癌DDP耐药细胞中miR-424-5p表达显著下调,ARK5表达显著上调;MTT试验显示,过表达miR-424-5p及干扰ARK5表达降低了DDP耐药细胞的耐药性,共同转染miR-424-5p mimic和pcDNA-ARK5逆转了miR-424-5p mimic单独转染对胃癌细胞耐药性的影响;Target Scan预测发现,ARK5是miR-424-5p的潜在靶基因,双荧光素酶试验证实ARK5是miR-424-5p的靶基因;Western-blot试验结果显示miR424-5p负向调控ARK5蛋白的表达。结论胃癌DDP耐药细胞中miR-424-5p表达下调,ARK5表达上调;miR-424-5p通过靶向抑制ARK5表达有效逆转胃癌DDP耐药细胞的耐药性。