枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

将编码枯草芽孢杆菌AS1.398 的中性蛋白酶功能区和包含前导区序列(“pro”序列)在内的全长基因克隆到酵母整合型质粒pPIC9K中,电转化His4 缺陷型巴斯德毕赤酵母SMD1168,通过MD-G418平板、PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDS-PAGE分析和酶活测定表明,枯草芽孢杆菌AS1.398的全长中性蛋白酶基因在毕赤酵母中获得了高效表达,表达产物分泌至培养基中,分子量约为43kD。经甲醇诱导培养后,发酵液中的中性蛋白酶活力达20000 U/mL。

羧甲基壳聚糖微球固定化AS1.398中性蛋白酶的制备和性质研究

以戊二醛为交联剂,制备羧甲基壳聚糖微球固定AS1．398中性蛋白酶。研究了羧甲基壳聚糖固定化酶微球的制备条件、固定化酶的适宜温度、pH、米氏常数和储存稳定性等性质。结果表明。在pH=7．0的中性环境下；交联剂与羧甲基壳聚糖摩尔比为0．4：1；干酶与羧甲基壳聚糖的质量比为0．125：1；在室温下交联至少4h。便可得到活力相对较高的固定化酶。自由酶和固定化酶的最适宜温度分别为40℃和65℃。在70℃下，固定化酶的热稳定性比自由酶要好。自由酶和固定化酶的最佳pH分别为7．0和6．0，固定化酶具有较宽的酸碱稳定性，在pH6～8都保持较高活力。固定化酶在5℃和35℃下储存1周后酶相对活力分别为97．6％和85．1％，而没有被固定的自由酶在5℃下储存1周酶相对活力仅为61．3％。自由酶和固定化酶的Km分别为5．66g／L和1．04g／L。

中性蛋白酶生产菌种AS1.398的多相复核鉴定

采用形态学观察、API生化鉴定系统、16S rRNA基因序列分析及gyr A、gyr B基因序列分析等相结合的微生物多相分类鉴定技术,对以中性蛋白酶生产菌种AS1.398枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)CICC 10888进行了复核鉴定,发现其分类学地位为解淀粉芽胞杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)。鉴于我国对生产菌种规范管理的要求和AS1.398中性蛋白酶生产菌种的广泛应用,建议将其分类学名称更名为解淀粉芽胞杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)。

AS1.398中性蛋白酶制备水解明胶(Ⅰ)——反应规律的研究

本文考察了游离AS1 398中性蛋白酶催化明胶水解反应时 ,不同温度、pH值、水解时间及酶用量等反应条件对该反应的影响规律 ,探讨了AS1 398中性蛋白酶应用于制备水解明胶工艺的可能性。

应用响应面法优化AS1.398中性蛋白酶的双水相萃取条件

选择PEG-柠檬酸钠双水相体系对AS1.398中性蛋白酶粗酶液进行萃取纯化研究,考察粗酶质量浓度、pH值、相比、离子强度等因素对酶分配的影响,并进一步采用响应面分析优化实验条件.结果表明:采用响应面方法可以有效地对系统进行选择和设计,大大方便了研究工作.选择PEG1000-柠檬酸钠体系,在粗酶质量浓度5.2 g/L、相比2、pH=7.1条件下,AS1.398中性蛋白酶的纯化倍数达3.6以上.

Expression, purification, and characterization of a thermophilic neutral protease from Bacillus stearothermophilus in Bacillus subtilis

The gene coding for a thermophilic neutral protease from Bacillus stearothermophilus was expressed in Bacillus subtilis DB104, under the control of the sacB gene promoter. This was followed by either the native signal peptide sequence of this protease or the signal peptide sequence of the sacB gene. The protease was purified 3.8-fold, with a specific activity of 16530 U mg-1. As analyzed by SDS-PAGE, the molecular mass of the expressed protease was about 35 kDa, and the optimal temperature and pH of the protease were 65℃ and 7.5, respectively. Moreover, it still had about 80% activity after 1 h reaction at 65 ℃ .

酶解法制备禾虫多肽液的工艺优化及其脱腥工艺探究

目的应用单因素和响应面实验优化禾虫的酶解工艺,结合模糊数学法探究一种有效的脱腥方法。方法以中性蛋白酶为酶解剂,禾虫为主要原料,研究液料比、酶用量、时间、温度、pH对酶解效果的影响。在单因素实验的基础上,以液料比、酶解温度、酶用量为自变量,禾虫多肽液的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率为响应值,通过Box-Behnken响应面法分析不同因素对酶解效果的影响,确定酶解的最优组合,并应用美拉德反应、硅藻土和酵母粉对禾虫多肽液进行脱腥实验,模糊数学法评价3种脱腥处理的效果。结果根据响应面实验得出禾虫的最佳酶解组合为:液料比1:1(g/mL)、酶解温度60℃、中性蛋白酶用量2450 U/g,得到酶解液的DPPH自由基清除率47.25%±0.11%;禾虫多肽液脱腥的最佳处理为:酵母粉添加量0.7%,反应温度35℃,反应时间30 min。结论中性蛋白酶酶解禾虫制备禾虫多肽液并采用酵母粉脱腥效果最佳,为禾虫的精深加工提供借鉴,促进禾虫产业的发展。

乳清蛋白酶解物对酸奶品质及抗氧化活性的影响

[目的]缩短酸奶发酵时间,提升乳品生产效率、酸奶营养价值和功能特性。[方法]研究乳清蛋白酶解物对酸奶多个指标影响,包括酸度、pH值、黏度、持水力、乳酸菌数量、感官品质、质构特性、抗氧化活性。[结果]在酸奶发酵过程中,酶解物能促进乳酸菌生长,提高发酵产酸能力,有效缩短发酵时间。然而,酶解物添加量超过4%时,酸奶黏度、持水力随酶解物添加量增加而降低。综合分析可知,乳清蛋白酶解物添加量4%时,酸奶感官品质、质构特性、抗氧化活性较佳。ABTS自由基清除率90.07%、DPPH自由基清除率74.94%、羟自由基清除率90.17%、还原力A700为0.657。[结论]在酸奶发酵过程中,添加适量乳清蛋白酶解物不仅缩短发酵周期,还提升酸奶品质、抗氧化活性。

蜜环菌发酵玉米醇溶蛋白中蛋白酶学性质研究

为探究大型食药用真菌胞外蛋白酶的相关特性,从蜜环菌发酵的玉米醇溶蛋白产物中分离、纯化蛋白酶,通过饱和硫酸铵沉淀粗酶液、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子层析柱及Sephadex G-50层析柱纯化,得到电泳纯的蛋白酶。结果表明,该蛋白酶的分子质量为18.4 ku;最适温度为60℃,在40~60℃具有良好稳定性;pH值为8时酶活力最高,pH值稳定性范围为6~8;Mn2+对该酶具有明显的促进作用,乙二胺四乙酸(EDTA)对中性蛋白酶有明显的抑制作用;米氏常数Km为3.786 mg/mL。研究结果为大型食药用真菌来源蛋白酶的研究与应用提供理论依据,为大型真菌源酶制剂的研发提出新思路。

五味子蛋白酶解前后抗氧化活性和功能特性

以五味子蛋白为原料,评价中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对五味子蛋白酶解前后的抗氧化活性和功能特性;根据两种蛋白酶最适酶解条件,对五味子蛋白酶解,通过扫描电子显微镜、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、游离巯基和二硫键含量测定分析其结构,并测定其体外清除羟基自由基、DPPH自由基和ABTS~+自由基的能力,测定亚铁离子螯合能力和铁离子还原能力,并对不同酶解产物的持水性、持油性、乳化性和乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性等功能特性进行评价;结果显示,五味子蛋白经酶解后相对分子量显著下降,中性蛋白酶酶解产物分子量最低,中性蛋白酶酶解产物水解度最高,为26.45%,酶解效果优于木瓜蛋白酶。以五味子蛋白为参照,酶解可以提升其抗氧化能力,中性蛋白酶酶解产物抗氧化能力优于木瓜蛋白酶酶解产物,但木瓜蛋白酶酶解产物具有较好的还原能力。五味子蛋白经酶解后,溶解性、乳化性和乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性均提高,并且中性蛋白酶酶解产物功能特性优于木瓜蛋白酶酶解产物。扫描电子显微镜观察到五味子蛋白经两种不同蛋白酶酶解后,产生不同程度的碎片和条状结构,并且木瓜蛋白酶的酶解产物中存在部分较大的片状结构,中性蛋白酶酶解产物呈现出细小的无规则碎片结构,相对松散。同时与五味子蛋白相比,两种酶解产物游离巯基含量均增加,其中中性蛋白酶酶解产物二硫键含量最小。综上,酶解可以降低五味子蛋白分子量,提升五味子蛋白的抗氧化活性和功能特性。

中性蛋白酶高温酶解条件下猪粪资源化利用中养分的变化规律

以酶工程及酶动力学为技术依托及科学依据,将猪粪加玉米秸秆组合作为底物,添加2%中性蛋白酶,在生化反应釜中80℃酶解3 h,底物含水量降低至56.01%,同比下降2.34%;大分子有机质含量降低至63.79%,酶解后,A、B处理的底物有机质含量分别降低了14.19%、15.06%;植物可利用大量元素提高至6.87%,符合NY 525—2012有机肥标准;速效磷、速效钾、全盐、总腐殖酸呈下降趋势;蛔虫卵死亡率达到92%,种子发芽指数达到54%,达到有机肥腐熟标准。

枯草芽孢杆菌对环境耐受性和产中性蛋白酶能力研究

为了探究枯草芽孢杆菌对环境耐受性及产中性蛋白酶的能力,试验模拟饲料加工温度、胃肠道酸性环境、胆盐对枯草芽孢杆菌进行环境耐受性评定,在单因素(pH值、时间、温度、接种量、碳源、碳源添加量和金属离子)试验基础上采用正交试验以中性蛋白酶活力为评定指标,对枯草芽孢杆菌培养条件进行优化。结果表明:枯草芽孢杆菌对温度、胃肠道酸性环境和胆盐均具有一定耐受性;单因素试验中最佳pH值为5,培养时间为24 h,培养温度为30℃,接种量为2%,碳源为淀粉,淀粉添加量为3%;金属离子Mg^(2+)、Fe^(2+)、Mn^(2+)、Cu^(2+)和Zn^(2+)对产酶均具有抑制作用,不在培养基中添加金属离子。正交试验优化后枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶活力最佳培养条件为pH值6,淀粉添加量3%,培养温度35℃,培养时间24 h,枯草芽孢杆菌种子菌液接种量3%,在最优条件下,酶活力可达40.05 U/mL。说明枯草芽孢杆菌可耐受动物胃肠道环境且培养条件优化后中性蛋白酶酶活力显著提高。

蛋白酶对羊肚菌水解液滋味和风味物质的影响

以游离氨基酸总量为指标,研究不同蛋白酶对羊肚菌的酶解效果,筛选羊肚菌酶解增鲜工艺最适蛋白酶,并采用单因素试验以及L9(34)正交试验,优化最适蛋白酶的水解工艺,在此基础上采用氨基酸分析仪及气质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技术对羊肚菌酶解前后氨基酸组成与挥发性风味物质进行分析评价。结果表明:中性蛋白酶酶解后游离氨基酸总量显著高于其他处理组,可以保持其鲜味和滋味的丰富性,因此选择中性蛋白酶对羊肚菌进行酶解处理。中性蛋白酶最佳酶解工艺条件为pH6.5、酶解温度45℃、中性蛋白酶添加量0.20%、酶解时间2.5 h。相较于未经酶解处理样品,该工艺条件下所得水解液(游离氨基酸总量220.54 mg/g)鲜味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸浓度增加;醇类、酮类、醛类等挥发性风味物质相对含量增加,可以作为羊肚菌调味品加工基料。

雌二醇通过Calpain 2有限水解integrinβ4促进乳腺癌SK-Br3细胞迁移浸润的相关机制

目的研究雌二醇通过calpain 2/integrinβ4促进人表皮生长因子受体(Her2)阳性的乳腺癌SK-Br3细胞迁移和浸润的相关机制。方法常规培养乳腺癌SK-Br3细胞,calpain 2的特异性抑制剂或雌二醇(E2)处理细胞,并对汇合度为60%(低密度)和90%(高密度)的细胞进行培养;通过细胞划痕实验检测SK-Br3细胞的迁移能力,Transwell-Matrigel实验检测SK-Br3细胞的浸润能力,免疫细胞化学技术和激光共聚焦扫描显微镜观察integrinβ4和Her2的表达与共定位,免疫共沉淀技术检测integrinβ4和Her2的相互作用,Western blot技术检测相关蛋白或蛋白片段的表达及蛋白磷酸化水平。结果划痕和浸润实验显示,相对于对照组,Calpain2抑制剂处理的SK-Br3细胞迁移和浸润能力减弱(P<0.05);免疫细胞化学成像显示,Her2和integrinβ4的共定位主要在细胞膜上,在胞浆也有少量共定位,用calpain inhibitorⅣ处理后,Her2和integrinβ4的表达减少,共定位也明显减少;免疫共沉淀实验发现,在Her2免疫沉淀物中可检测到integrinβ4,在integrinβ4免疫沉淀物中可检测到Her2;给予calpain inhibitorⅣ处理,可以减少Her2和integrinβ4之间的免疫共沉淀;Western blot检测发现,高密度培养乳腺癌SK-Br3细胞中的integrinβ4比低密度培养的水解程度高;在高密度培养条件下,E2可以促进这些integrinβ4水解片段的产生,上调calpain 2的表达,也伴随着integrinβ4水解程度的增加,同时使Src的Y418位点的磷酸化水平增高。结论高密度培养条件下,E2可通过上调和激活calpain2,促进integrinβ4的有限水解,促进integrinβ4和Her2的相互作用,磷酸化激活Src,促进SK-Br3细胞的迁移和浸润。

中性蛋白酶辅助提取天麻淀粉的工艺优化

以新鲜天麻为原料、中性蛋白酶为酶解剂,通过单因素和正交试验研究料液比、酶解时间、酶解pH、酶添加量和酶解温度对天麻淀粉中蛋白质残留率和天麻淀粉得率的影响,并确定最佳提取工艺。结果表明:天麻淀粉提取最佳工艺为料液比1∶7(g/mL)、酶解时间2.5 h、酶解温度35℃、酶添加量0.8 mg/g、酶解pH 7.0,在此条件下天麻淀粉得率为12.49%,蛋白质残留率为0.0068%。

双酶法制备大米多肽的研究

试验以大米蛋白为原料,利用碱性蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解的方法,结合超声处理技术,制备大米蛋白肽,并通过傅里叶变换红外光谱仪和氨基酸分析仪对产物性质进行分析。试验结果表明,大米蛋白经过复合酶解后,溶解度和溶液中短肽含量都有显著提高,产物的红外出峰位置与蛋白肽基本一致,具备多肽基本结构,并且产物具有8种必需氨基酸,氨基酸组成丰富,具有较高营养价值。

低苯丙氨酸紫苏肽制备工艺研究

为丰富低苯丙氨酸特殊医学用途配方食品,本研究以紫苏籽粕(脱脂)为原料,通过单因素及响应面分析法优化双酶水解工艺,同时探究活性炭吸附游离苯丙氨酸的条件。结果表明,双酶法水解紫苏蛋白以制备低苯丙氨酸紫苏肽的最佳工艺为:选择中性复合蛋白酶(pH 7.0)和氨基肽酶(pH 8.0),分别在55℃条件下依次水解紫苏籽粕5.0、5.5 h。采用200目活性炭吸附水解后游离的苯丙氨酸,经高效液相色谱检测,紫苏蛋白中苯丙氨酸释放率为96.54%,苯丙氨酸去除率为97.64%,产物中苯丙氨酸质量分数为1.10 mg/g,满足《食品安全国家标准特殊医学用途配方食品通则》(GB 29922—2013)中对苯丙氨酸含量的要求。本研究为低苯丙氨酸特殊医学用途配方食品的制备提供了一种有效的方法,对于推广这类食品有重要的现实意义。

绿豆抗氧化肽的制备及理化特性分析

通过体外抗氧化活性、氨基酸组成及结构特征等指标对绿豆抗氧化肽最佳水解酶进行筛选,采用单因素与响应面实验优化制备工艺,并对制备的绿豆抗氧化肽进行理化特性分析。结果表明,中性蛋白酶制备的绿豆肽抗氧化活性最强,疏水性和芳香族氨基酸的含量较高,分别为261.85、73.42 mg/g,且具有较强的表面疏水性;从结构分析中可看出其具有较强的疏水性结构,中性蛋白酶水解后微观结构由紧密的球状分布变为多孔的碎片状分布,粒径变小,证实绿豆肽的抗氧化性与氨基酸组成及疏水结构密切相关。优化后的最佳酶解工艺为底物浓度30 mg/mL,加酶量2.24%,酶解时间3 h,酶解温度50℃,溶液pH 6.97,此条件下制备的绿豆抗氧化肽以小于1000 u的肽段为主,占比为87.65%,水解度为18.70%,DPPH·清除率为(85.61±0.37)%,且发现其浓度与抗氧化活性呈正相关的量效关系。

香菇酱油制曲工艺的优化

以豆粕、小麦、烘干粉碎的香菇为原料制备香菇酱油成曲,研究成曲润水量、经过香菇驯化后的米曲霉AS3.042接种量、香菇添加量和制曲时间4个因素对香菇酱油成曲中性蛋白酶活性的影响,通过正交试验优化了制曲工艺。研究结果表明,对成曲中性蛋白酶活性影响从大到小依次为接种量>香菇添加量>制曲时间>润水量。香菇酱油制曲工艺最佳条件为米曲霉接种量0.8×10^(6)个/g、香菇添加量3%(质量比)、制曲时间54 h、成曲润水量54%(质量比)。在此优化条件下发酵的香菇酱油成曲的中性蛋白酶活性可达4 414.31 U/g干曲。

响应面优化姜黄淀粉的酶法提取工艺

【目的】优化姜黄淀粉酶法提取工艺,提高姜黄淀粉提取率。【方法】以新鲜姜黄为原材料,姜黄淀粉提取率为指标,在几种蛋白酶中筛选最佳酶,采用单因素试验进一步确定提取酶解时间、酶解温度、酶解pH和中性蛋白酶添加量等4个因素影响姜黄淀粉提取率的优化范围。在单因素试验基础上,采用Box-Behnken方法,进行4因素3水平响应面优化设计,共进行29组处理,每组处理3次重复,考察酶解时间、酶解温度、酶解pH和中性蛋白酶添加量等4个因素对姜黄淀粉提取率的影响,从而确定姜黄淀粉酶法提取的最佳工艺条件。【结果】姜黄淀粉提取最佳工艺参数为:酶解pH6.83、酶解温度51.45℃、酶解时间6.20 h、中性蛋白酶添加量0.13%,姜黄淀粉提取率的理论值为62.00%。考虑实际操作的简便,确定姜黄淀粉提取的最佳工艺参数为:酶解时间6 h,酶解温度52℃,酶解pH6.8,中性蛋白酶添加量0.13%,在此条件下实际验证值为60.42%,拟合得到的模型与实际吻合良好。【结论】通过响应面法优化了姜黄淀粉的酶法提取工艺条件,提高了姜黄淀粉提取量,为姜黄淀粉的工业化生产提供了理论依据。