云南苹果产区苹果茎沟病毒(ASGV)的发现及其分子变异

【目的】为了查明云南省苹果产区的苹果茎沟病毒病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)的侵染情况和不同来源分离物间的分子变异情况,【方法】以云南昭通、丽江、昆明、曲靖等地采集的325份苹果病毒样品为试材,采用RT-PCR技术对其是否携带ASGV进行检测,运用DNAMAN6.0、MEGA5.0对实验获得的6个分离物和GenBank上已登录的34个分离物进行序列比对分析。【结果】ASGV在云南各大苹果产区的发病率高达48%。序列比对结果显示,这些分离物的核苷酸序列相似性为87.3%～93.8%,氨基酸序列相似性为90.7%～98.7%。系统发育树显示,云南的6个分离物聚为一簇,而陕西省苹果分离物YL06与云南省分离物ZT1、TJX1亲缘关系比较近,聚为一支;ASGV苹果分离物要明显区别于ASGV梨分离物和CTLV柑橘分离物。【结论】云南省苹果产区苹果树的ASGV带毒率高达48%,推测可能是一种发生率比较普遍的病毒病,这是云南省发现的首次报道。系统发育树显示:本研究获得的6个苹果分离物明显区别于其他寄主分离物,并且与其他地区的分离物具有一定差异,推测在我国,ASGV的分子变异与寄主/地域来源存在着一定的相关性。

ASGV231型分条整经机的工艺调查

主要叙述了新产品ASGV231型分条整经机的技术参数、工艺实践和性能比较情况。对某些织物的工艺进行了较详细的介绍，可供生产管理者和有关人员决策参考。

ASGV231型分条整经机在涤纶加捻长丝上的应用

介绍了ASGV231型分条整经机的结构性能和生产试验情况以及在涤纶加捻长丝上的应用。

ASGV321型长丝浆丝机冷却系统的设计

ASGV321型长丝浆丝机适应于50～150D无捻、少捻涤纶长丝等各种合纤长丝的上浆.合纤长丝区别于其他纤维的一个显著特点就是受热后易产生热收缩,上了浆的经丝经过烘干和上蜡(油)后温度仍然较高,如不迅速冷却定形,蜡液或其他表面预处理剂未固化,即卷取成浆轴,则一方面蜡液未干容易损坏浆膜,另一方面热应力未消除.卷成的浆轴容易变形、增温.为此,我们在经丝烘干上蜡(油)后进入车头卷取前设置了一套冷却系统,以保证经丝烘干上蜡(油)后迅速降至室温后卷取.

ASGV221型长丝整经机研制成功

1种新设备——ASGV221型长丝整经机,在江苏射阳纺机厂研制成功,填补了1项国内空白,使我国纺织行业整经技术向长纤维、高速度、大卷装、恒张力方向迈出一大步。

实时荧光RT-PCR一步法检测苹果茎沟病毒

根据苹果茎沟病毒(ASGV)各分离物外壳蛋白(CP)基因的保守序列,设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan-MGB探针,建立了对ASGV的实时荧光RT-PCR检测方法。TaqMan-MGB探针3’端具有小沟结合分子(Minor groove binder, MGB),提高了探针的Tm值,缩短了探针长度,解决了病毒各分离物之间基因组变异较大、难以找到较长一致的序列来设计探针的困难。该方法的检测灵敏度比常规RT-PCR电泳检测高约10倍,对于ASGV等在果树体内含量较低的病毒尤为适用。此方法快速、灵敏,整个检测过程完全闭管,无需PCR后处理。

几种苹果实生砧木种子传毒潜力检测

【目的】明确不同苹果实生砧木种子传毒的情况及各病毒的种传潜力。【方法】以八棱海棠、沙果、平邑甜茶、楸子和山定子5种苹果砧木母株和实生苗为试材,运用RT-PCR技术对母株和实生苗的苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)的携带情况进行检测。【结果】八棱海棠母株携带ASGV、ACLSV和ASSVd,侵染率均为100%,其实生苗带ASGV和ASSVd,侵染率分别为3.3%和26.7%;沙果母株同时被4种病毒侵染,其中ASGV侵染率为40%,ACLSV为80%,ASPV和ASSVd侵染率均为100%,实生苗仅携带ASSVd,携带率为100%;平邑甜茶母株被ACLSV、ASPV和ASSVd复合侵染,实生苗被ASSVd侵染,侵染率均为100%;楸子母株同时携带ASGV、ACLSV和ASSVd,3种病毒携带率分别为60%、100%、100%,实生苗携带ACLSV、ASPV和ASSVd,侵染率分别为43.3%、70%、23.3%;山定子母株同时携带ACLSV和ASSVd,带毒率均达100%,实生苗仅检出ASSVd,带毒率为30%。【结论】苹果锈果类病毒可以通过种子传毒,而苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎痘病毒不通过种子进行传播。

检测砂梨潜隐病毒的IC-RT-PCR和TC-RT-PCR的研究

以砂梨为试材,在生物学和血清学检测的基础上,采用免疫捕作RT-PCR穴IC-RT-PCR雪和试管捕作RT-PCR穴TC-RT-PCR雪技术,对苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)和苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV)进行了检测分析。结果表明,TC/IC-RT-PCR均能有效检测梨粗提液中的ACLSV和ASGV,分别获得了大小约358bp和499bp的目标扩增片段;但IC-RT-PCR检测ACLSV的效果受到病毒分离株间血清学关系影响。与传统的RT-PCR相比,IC/TC-RT-PCR不仅灵敏度更高,而且不需提取总RNA,可以简化操作程序和减少苯酚、氯仿类有机试剂对人体的伤害和对环境的污染,适合于大量梨样品的病毒快速灵敏检测。

苹果茎沟病毒实时荧光RT-PCR反应体系的优化

以健康昆诺阿藜叶片和受ASGV侵染的昆诺阿藜叶片为试材,利用Trizol试剂提取植物总RNA,将实时荧光RT-PCR体系的主要成分设定梯度,根据每个成分的变化引起的(Rn值和Ct值的差异,探讨苹果茎沟病毒实时荧光RT-PCR技术中反应体系的主要成分对扩增结果的影响。最终确定了RT-PCR反应体系的最佳条件为:25μL体系中,Mg2+浓度为3.5 mM,引物浓度为0.6μM,探针浓度为0.6μM,总RNA含量为20 ng。利用此反应体系进行扩增,△Rn值比未优化时高出一个数量级,表明该体系适合ASGV实时荧光RT-PCR检测分析。

两步多重RT-PCR快速检测苹果潜隐性病毒

【目的】为建立检测3种苹果潜隐性病毒更为快速准确的方法，【方法】以携带苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）和苹果茎痘病毒（ASPV）的成龄苹果树韧皮部为试材，根据基因库中苹果茎痘病毒（Apple stempitting virus，ASPV）的外壳蛋白基因序列，设计合成了2对特异性引物，分别与合成的苹果茎沟病毒（ASGV）引物和苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）的引物组合配伍，筛选出最佳的引物对组合。对eDNA的合成所用引物和总RNA模板进行遴选和量化，对PCR过程中eDNA的用量、引物对的终浓度、退火温度等主要影响因素进行优化。【结果】结果表明，反转录引物为Oligo（dT）18、总RNA0．1～3．0μL时，可以得到较好的eDNA；ASPV—FR与ASGV—Pch、ACLSV—Pch引物组合优于ASPV—Pch，并且筛选出4组最佳的终浓度处理组合；eDNA用量为2．0-4．0μL、退火温度为50．0～52．9℃、循环数为35时，扩增效果较好。采用优化的多重RT—PCR体系对采自陕西和山东两省的样品进行检测，并用3种病毒的单重RT—PCR体系进行验证。【结论】结果呈现高度一致性，充分印证了该多重RT—PCR体系的准确性，适用于大量样品的快速检测。

苹果茎沟病毒梨分离物外壳蛋白基因的克隆和序列分析

选取生物学和血清学特性存在较大差异的苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)梨分离物P-6-1-17、P-4- 1-69、P-L2和P-D-21,采用RT-PCR法对3’端进行扩增,所获扩增片段经序列测定,全长分别为1089 nt(P-6-1-17、P-L2)和 1069 nt(P-4-1-69、P-D-21)。4个分离物的CP基因均由714 nt组成,其核苷酸和推导编码蛋白氨基酸序列同源性分别为 89．8％-96．4％和94．9％-97．9％。将我国4个分离物的CP基因与已报道ASGV分离物及分子变种进行序列同源性比较和系统进化树分析,结果表明我国ASGV分离物至少可分为2个组群,其中生物学表现明显不同于其它分离物的P-L2, 其CP基因核苷酸序列显示较大的变异。

苹果茎沟病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备

构建了来源于梨的苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)分离物P-4-1-69和P-L2的原核表达载体pET-P-4-1-69和pET-P-L2,转化大肠杆菌BL21(DE3),在1 mmol.L-1 IPTG下诱导表达。SDS-PAGE和用商业化ASGV抗体对诱导表达产物进行Western Blot分析结果表明,2个分离物的外壳蛋白基因(cp基因)在大肠杆菌中成功地进行了高效表达,重组外壳蛋白的大小约为31 ku。分别用含分离物P-4-1-69和P-L2的重组外壳蛋白的胶条免疫大耳白兔,制备了抗ASGV重组外壳蛋白的抗血清。采用间接ELISA法用所制备的抗血清对回收的重组外壳蛋白进行检测,当抗分离物P-4-1-69和P-L2的重组外壳蛋白的抗血清分别稀释512 000倍和64 000倍时,检测结果仍为阳性。Western Blot分析和组织免疫印迹检测(Tissue blotting immunoassay,TBIA)结果表明,纯化的抗体具有较强的特异性,可有效检测梨样品中的ASGV。

3种梨树病毒cDNA探针检测

利用Biotin-16-dUTP标记的cDNA探针分子杂交检测分析了新疆梨树上的3种主要病毒(梨环纹花叶病毒、梨脉黄病毒、苹果茎沟病毒)并优化了杂交反应体系。结果表明,这3种病毒探针的检测灵敏度分别为5、10和10 pg。用文中的方法提取的RNA均能在10-3稀释后显色。该方法与RT-PCR方法对样品带毒状况的检测结果一致。

用离体微嫁接法快速检测苹果潜隐病毒

用离体微嫁接法同时检测了苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒和苹果茎痘病毒。由于苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒 ,症状是在叶部表现黄斑 ,试管内不易观察 ,病毒检出率较低 ,检测带毒率分别为37.5%和 6 1 .1 % ,在检测苹果茎痘病毒上取得成功 ,检出率达 81 .3%以上。用木本指示植物跟踪检测了带毒品种 ,试验证明采用离体微嫁接法检测果树病毒比用木本指示植物检测所需时间短 。

苹果茎沟病毒对梨树幼苗生长及过氧化物酶活性的影响

Based on growth level and peroxidase activity,a comparative study and paried-samples t test were made between virus-free Zaosu pear seedlings and the seedlings inoculated with apple stem grooving virus(ASGV). The results showed : (1) virus-free Zaosu pear seedlings grew better than inoculated ones. Of the seedlings the height,diameter,branches and autumn braches differed statistically significantly; (2)the peroxidase activity of inoculated seedlings was higher than that of virus-free ones,and the peak of peroxidase activity occurred on about d 7 and d 24 after inoculation. Fig 1,Tab 1,Ref

中国西南主要苹果产区潜隐性病毒分子鉴定

为了深入了解苹果受潜隐性病毒的影响情况,本研究针对云南、贵州、四川三省的387份苹果叶片样本,利用RT-PCR及多重RT-PCR技术,分析鉴定了三种苹果潜隐性病毒——苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果茎沟病毒(ASGV)和苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)在苹果上的发生现状.结果显示,苹果样本中ASPV阳性率为89.4%,ASGV阳性率为100%,ACLSV阳性率为81.6%,且它们多为混合感染,共计304份样本同时感染了三种病毒,混合感染率为78.5%.与云南、贵州相比,采自四川的苹果样本受潜隐性病毒感染最为严重.本研究报道了我国西南苹果主产区潜隐性病毒感染现状,建立了一套快速有效的苹果潜隐性病毒分子生物学鉴定方法.

苹果茎沟病毒外壳蛋白抗体制备与应用

从苹果寄主上分离得到了苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)中国株系。经基因克隆,测序后发现苹果茎沟病毒中国株系外壳蛋白基因(coat protein,CP)含有714个核苷酸,编码表达由237氨基酸残基组成的27 ku蛋白。通过构建含有ASGV-CP基因的重组表达载体pECASGV-CP,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达ASGV-CP蛋白。SDS-PAGE显示其分子质量与预计大小一致。利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体。该抗体可用于Western blot和DAS-ELISA检测技术。基于血清学检测,发现陕西苹果主产区ASGV发生普遍。

利用原位RT-PCR技术检测库尔勒香梨中苹果茎沟病毒

以已知带有苹果茎沟病毒的香梨的叶片为材料,研究了香梨病毒叶片石蜡切片IS-RT-PCR检测技术。应用了直接原位RT-PCR反应,简化了试验步骤,缩短了试验周期,确定了苹果茎沟病毒在叶片中的分布位置。试验中设置了多种阴性对照,结果表现为:阴性对照组织中均未显现蓝紫色,而阳性材料组织的一些细胞表现出明显的蓝紫色,说明苹果茎沟病毒在叶片中主要分布于细胞中的栅栏组织。

苹果茎沟病毒微滴数字RT-PCR检测方法的建立和应用

我国是第一大苹果生产国。苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)在我国各苹果产区分布广泛,侵染果树导致树势变弱,生长量减少,果实品质下降,严重威胁我国苹果产业的可持续发展。病毒检测是果树病毒病防控的重要前提。本研究根据苹果茎沟病毒外壳蛋白基因保守序列,设计了引物和探针,建立了微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法。所建立的检测方法能特异性检出苹果茎沟病毒,检测重复性好,灵敏度比qRT-PCR法高10倍,可适用于田间样品及组培苗检测。该方法的建立为苹果茎沟病毒的检测提供了重要的技术手段。