肝豆状核变性患者的临床表型和ATP7B基因变异分析

目的:分析我国北方部分地区肝豆状核变性(wilson disease,WD)患者的临床特征及ATP7B基因变异情况。方法:以2018年11月至2022年4月期间在河南大学附属郑州颐和医院确诊的50例WD患者为研究对象,提取患者外周血基因组DNA,采用PCR扩增后用Sanger法对患者ATP7B基因外显子/内含子连接区进行序列分析。结果:50例WD患者根据临床症状分为肝型14例、脑型28例和其他型8例。50例WD患者中ATP7B基因变异结果:纯合子3例,复合杂合子32例和单一杂合突变13例,三处杂合突变1例,四处杂合子突变1例。共检测到30种不同的ATP7B基因突变,突变频率比较高的为p.Arg778Leu,p.Pro992Leu,p.Ala874Val,p.Arg919Trp,p.Val1106Ile。结论:本研究发现肝型WD患者发病早期主要表现为转氨酶升高,血清铜蓝蛋白降低,且以幼儿为主。p.Arg778Leu和p.Pro992Leu为ATP7B基因常见的突变,共发现30种ATP7B基因突变,为WD的早期确诊、家系筛查及产前诊断提供科学依据。

肝豆状核变性儿童临床表型与ATP7B基因突变谱变化研究

目的总结肝豆状核变性(WD)儿童临床表型特征及其ATP7B基因突变谱变化。方法2020年1月~2023年1月我院收治的WD患儿62例,其中肝病组41例(临床型11例和亚临床型30例)和神经病组21例(临床型6例和亚临床型15例),采用直接测序法检测外周静脉血ATP7B基因突变谱,登录ATP7B突变数据库,比对突变结果。采用火焰原子吸收光谱法检测24 h尿铜和血清铜蓝蛋白。结果肝病组起病年龄、角膜K-F环发生率、血清谷丙转氨酶和24 h尿铜水平分别为(6.1±2.5)岁、17.0%、(149.6±51.3)U/L和(157.0±25.7)μg,与神经病组【分别为(9.6±2.9)岁、76.1%、(67.1±11.0)U/L和(272.2±30.8)μg】比,差异均具有统计学意义(P<0.05);临床型肝病组起病年龄、角膜K-F环、血清胆汁酸、谷丙转氨酶和24 h尿铜水平分别为(6.8±1.9)岁、54.5%、(158.5±23.6)μmol/L、(279.6±17.5)U/L和(196.6±62.8)μg,与亚临床型肝病组【分别为(5.1±2.3)岁、3.3%、(16.1±4.1)μmol/L、(90.5±12.1)U/L和(118.1±41.0)μg】比,差异均具有统计学意义(P<0.05),临床型神经病组角膜K-F环、血清胆汁酸、谷丙转氨酶和24 h尿铜水平分别为100.0%、(26.8±5.8)μmol/L、(96.7±10.1)U/L和(376.5±48.9)μg,与亚临床型神经病组【分别为66.7%、(14.4±3.2)μmol/L、(48.5±5.2)U/L和(214.7±55.4)μg】比,差异均具有统计学意义(P<0.05);在ATP7B基因突变谱中,c.2333G>T(Arg778Leu)见于41个等位基因,等位频率占比为33.1%,其次为c.2975G>T(Pro992Leu),见于10个等位基因,等位频率占比为8.1%,再次为c.2621C>T(Ala874Val)、c.1708-5t>g(Ala874Val)和c.994G>T(Glu332stop),等位频率占比分别为4.8%、3.2%和3.2%;检测到错义突变34种,插入突变15种,剪切突变8种,无义突变5种;复合杂合突变45例,杂合突变7例,纯合突变10例;肝病组与神经病组前5致病变异基因(p.Arg778Le、p.Pro992Leu、p.Ala874Val、IVS4-5:t>g和p.Glu332stop)突变频率比较无统计学差异(P>0.05)。结论WD儿童以肝脏受累多见,排名前5位的致病变异有Arg778Leu、Pro992Leu、Ala874Val、Ala874Val和Glu332stop,因此为诊断可以优先选择检测这些热点基因,但基因检测可能无法预测临床表型。

中国人Wilson病ATP7B基因Arg778Leu/Gln点突变与中医证型的相关性研究

目的 :探讨中国人Wilson病 (WD)ATP7B基因Arg778Leu/Gln点突变与中医证型的关系。方法 :应用PCR技术分别扩增 90例WD患者和 30名健康人ATP7B基因的第 8外显子 ,其PCR产物行限制性内切酶MspⅠ酶切分析。 90例WD患者进行中医辨证分型。结果 :90例WD患者有 34例Arg778Leu/Gln点突变 ;WD患者中医辨证分型属肝风内动者Arg778Leu/Gln点突变占 2 0例。 结论 :Arg778Leu/Gln点突变组患者的发病年龄迟于未见该点突变组的患者 。

ATP7B基因反义寡核苷酸对卵巢癌SKOV3ipl细胞顺铂敏感性的影响

目的探讨ATP7B基因反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODNs)片段对卵巢癌SKOV3ip1细胞顺铂敏感性的影响。方法人工合成包含ATP7B mRNA翻译起始位点的ASODNs片段及作为对照的正义寡核苷酸(sense ol-igodeoxynucleotide,SODNs)片段。脂质体lipofectamine2000(LF)将ASODNs及SODNs转染卵巢癌SKOV3ip1细胞后,用RT-PCR法、流式细胞测定法、Western blot及MTT法检测SKOV3ip1细胞转染后,ATP7B基因mRNA、蛋白表达及半数抑制浓度(IC50)的变化。结果SKOV3ipl细胞以及转染ASODNs后,ATP7B与β-actin mRNA的光密度比值分别为0.831±0.06和0.203±0.07(P<0.01)。流式细胞法检测细胞内ATP7B蛋白的荧光强度由转染前的79.42±4.04下降到50.87±5.47(P<0.05)。Western blot检测SKOV3ipl细胞以及转染ASODNs后,ATP7B与actin蛋白的光密度比值分别为2.60±0.44和1.01±0.06(P<0.01)。MTT检测IC50由转染前的(126.63±12.06)μmol/L下降为(80.90±20.09)μmol/L(P<0.01)。而转染SODNs及LF的SKOV3ip1细胞中,上述指标无统计学差异(P>0.05)。结论ATP7B基因反义寡核苷酸能显著抑制卵巢癌SKOV3ip1细胞ATP7B mRNA和蛋白表达,并能增加SKOV3ip1细胞对顺铂的敏感性。

Wilson病ATP7B基因铜离子结合区缺失突变体构建及功能研究

【目的】构建ATP7B基因铜离子结合区缺失突变体,研究其在Tx小鼠肝细胞中的表达及功能。【方法】利用长片断PCR和质粒重组技术构建不同铜离子结合区的缺失体,脂质体介导转染Tx小鼠肝脏细胞,然后进行高铜、低铜孵育,观察ATP7B突变蛋白在细胞内的定向移动及对铜离子转运功能的影响。【结果】ATP7B基因1-4铜离子结合区逐个缺失后,ATP7B蛋白定向移动减慢至消失;5-6铜离子结合区缺失,细胞铜转运功能停滞。【结论】ATP7B基因6个铜离子结合区功能不同,其中1-4结合区主要根据铜浓度诱导ATP7B蛋白细胞内定向移动,而5-6结合区则直接参与铜离子细胞外转运。

儿童肝豆状核变性临床表型及ATP7B基因突变关联性分析

目的了解汉族儿童肝豆状核变性(WD)患儿的临床表型与ATP7B基因突变的相关性。方法以2005年7月至2012年12月就诊于复旦大学附属儿科医院确诊WD患儿为研究对象,按起病部位分为肝病型和神经型,以临床表现分为临床型和亚临床型。采用PCR技术扩增ATP7B基因全部外显子并直接测序。提取临床表型和基因型的信息;分析两者之间的相关性。结果 52个无亲缘关系家庭的53例WD患儿进行分析。肝脏损害52例(98.5%)。肝病型41例,神经型12例;临床型19例,亚临床型34例。①肝病型ALT升高明显;神经型24 h尿铜水平、胆汁酸水平和K-F环阳性率均显著高于肝病型;亚临床型起病年龄、ALT或AST异常率显著高于临床型;24 h尿铜水平、胆汁酸升高比例和K-F环阳性率显著低于临床型。②53例WD患儿ATP7B基因外显子序列分析发现致病性突变等位基因97个,突变频率为91.5%。纯合突变8例,复合杂合36例,杂合突变9例。错义突变23种,插入/缺失突变8种,无义突变2种,剪接突变3种。③错义突变与非错义突变,纯合突变与杂合突变患儿在起病年龄、K-F环阳性率、铜蓝蛋白水平、24 h尿铜水平和ALT、AST异常率等方面差异无统计学意义。④3种高发突变p.Arg778Leu(35.0%,34/97)、p.Pro992Leu(15/97,15.5%)和p.Ala874Val/Pro(5/97,5.2%)在临床型和亚临床型、肝病型和神经型间的分布差异无统计学意义。⑤纯合、错义和错义+剪接突变在临床型和亚临床型、肝病型和神经型间的分布差异无统计学意义。结论 WD患儿几乎均有肝脏受累,多以肝病表现起病。ATP7B常见突变为p.Arg778Leu、p.Pro992Leu和p.Ala874Val,常见基因型和临床表型间未发现显著相关性。p.Ala874Val/Pro突变患儿起病年龄较低,剪接突变对血清铜蓝蛋白影响较小。

肝豆状核变性患者ATP7B基因突变类型及中西医结合治疗效果与中医分型的相关性研究

目的观察肝豆状核变性(WD)患者基因突变类型及中西医结合治疗效果与中医分型的关系。方法对95例WD患者进行八纲及脏腑辨证分型;提取基因组DNA,PCR扩增其ATP7B基因的第8、12号外显子,对扩增产物直接测序,分析基因突变类型与中医分型的关系;同时对患者采用中西医结合强力排铜治疗1个月,对疗效再次与中医分型作相关性研究。结果95例WD患者8号外显子Arg778Leu点突变35例,其中22例属肝风内动型;而12号外显子测序有13例Thr935Met杂合点突变,6例属痰湿内阻型;经过1个月强力排铜后,发现不同中医类型的治疗疗效之间比较无显著差异,但肝风内动型和痰湿内阻型总有效率优于气血亏虚型。结论Arg778Leu点突变可能与肝风内动相关,Thr935Met点突变与中医证型无相关性;中西医结合治疗效果与中医证型之间无相关性。

与ATP7B基因紧密连锁的微卫星DNA单体型在汉族Wilson病的多态性分析

目的 了解与ATP7B基因紧密连锁的微卫星DNA(D13S314 ,D13S30 1和D13S316 )单体型在正常人、Wilson病 (WD)患者及其杂合子的分布特点及意义。方法 采用荧光标记 3个短串联重复标记 (D13S314 ,D13S30 1和D13S316 ) ,测序定位和GenotypeTM 软件技术分析 71例WD患者和 12 3位父母的单体型。结果 在D13S314 ,D13S30 1和D13S316位点分析中得到 71例WD患者和 12 3位携带者及 5 4例正常个体等位基因片段 ;片段大小分别为 134～ 15 7bp,12 8～ 15 6bp 和 136～ 15 4bp;获得等位基因数分别为 19,2 0和 15个 ;3个位点的杂合率分别是 0 .79,0 .82和 0 .2 3。D13S314 ,D13S30 1和D13S316位点的等位基因分布在WD患者和正常人群之间明显不同 ,其中D13S314和D13S30 1位点显示各有 9个等位基因片段存在明显差异 (P <0 .0 5 ) ,D13S316位点显示有 4个等位基因片段存在明显差异 (P <0 .0 1) ;显示的 81种单体型中以 12 6 5 ,15 10 5 ,6 10 5和 6 14 5最多见 ,分别占 5 .2 % ,4 .5 % ,4 .5 %和 3.7% ,其次为 12 8 5 ,12 9 5和 6 16 5 ,各占 3.0 % ,13 10 8,6 13 5 ,6 14 13和 6 9 5各占 2 .2 %。结论 单体型的类型较多可能和基因突变的类型多样化相关 ,D13S314 D13S30 1 D13S316的单体型分析对WD的诊?

肝豆状核变性患者肝细胞中P型ATP7B酶水平及功能的研究

目的探讨肝豆状核变性(HLD)患者肝细胞中P型ATP7B酶水平及功能。方法采用细胞培养技术,将9例HLD患者和5例非HLD脾破裂或胆囊疾病患者(对照组)的肝细胞行体外培养。采用SDSPAGE电泳及Westernblot蛋白印迹技术,测定两组肝细胞中P型ATP7B酶水平并进行比较。结果与对照组相比,9例HLD患者均出现电泳条带的改变,其中3例于155×103处的条带接近正常,1例未见明显条带,5例该条带有不同程度稀薄、色淡;6例出现异常的特异性反应条带。结论HLD患者肝细胞内存在ATP7B基因各种形式的变异,程度不等的P型ATP7B酶量和/或质的异常是导致铜代谢障碍的原因。

河南贲门癌高发区贲门癌组织ATP7B的表达

目的:了解贲门癌组织中ATP7B的表达情况。方法:采用免疫组化ABC法检测49例河南贲门癌高发区贲门癌及其相应癌旁正常组织中ATP7B的表达。结果:ATP7B在贲门癌组织中阳性表达率为51%(25/49),高于癌旁正常组织中的29%(14/49),差异有统计学意义(χ2=5.15,P<0.05)。贲门癌组织ATP7B表达与肿瘤体积、淋巴结转移和远处转移无关,而与肿瘤分化程度有关。结论:ATP7B在贲门癌对铂类抗肿瘤药的先天耐药形成过程中发挥了重要作用,ATP7B可作为贲门癌的预后判断指标。

pcDNA3.1(+)/ATP7B对TX小鼠成纤维细胞铜代谢的影响

【目的】研究Wilson病野生型基因ATP7BcDNA真核表达载体pcDNA3.1(+)/ATP7B对TX小鼠成纤维细胞铜代谢的影响。【方法】构建人Wilson病野生型基因ATP7BcDNA的真核表达载体pcDNA3.1(+)/ATP7B。随机选取TX小鼠20只构建TX小鼠的成纤维细胞模型,平行分成3组,一组未加质粒,另两组分别加入等量pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)/ATP7B,观察对细胞模型铜代谢的影响。并进行免疫组化实验以观察表达是否增强。【结果】实验前未加质粒组,加入pcDNA3.1(+)组与加入pcDNA3.1(+)/ATP7B组细胞内铜含量分别为(78±20),(77±17),(75±13)ng/mg;实验后分别为(76±20),(74±13),(40±10)ng/mg。与未加质粒组和加入pcDNA3.1(+)相比,加入pcDNA3.1(+)/ATP7B组的细胞内铜含量显著下降(P皆<0.01),其细胞内ATP7B蛋白的表达明显增强。【结论】Wilson病真核表达载体pcDNA3.1(+)/ATP7B在TX小鼠成纤维细胞水平上确有排铜作用。

肝豆状核变性ATP7B基因突变的研究进展

肝豆状核变性是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病,由ATP7B基因突变引起,其临床表型受基因、年龄、饮食、种族、代谢等多种因素的影响。ATP7B基因突变以错义突变为主,最常见的突变类型为H1069Q和R778L。ATP7B基因突变可引起编码蛋白ATP7B的构象改变、表达减少及定位异常等,导致转运铜功能的减弱或缺失,引起铜在肝脏、脑等部位的沉积。目前,肝豆状核变性尚不能被彻底治愈,后期可进展成肝衰竭甚至死亡。

中国人肝豆状核变性基因(ATP7B)第16号外显子的突变特征

为探讨中国人肝豆状核变性基因（ATP7B）第16号外显子的突变特征，应用聚合酶链反应-单链构象多态（PCR－SSCP）技术对无亲缘关系的44例肝豆状核变性患者和60名正常人的ATP7B基因第16号外显子，进行了突变及多态的筛查。发现3例患者具有与正常对照不同的单链构象，进一步经DNA测序证实其中2例发生了Ileull48Thr突变，另回例发生Glull73Lys突变。上述突变均为国际上未报道过的新型错上突变。此外，还发现2种多态现象，其中Valll40Ala与文献报道一致，而3498C—T的改变则是一种本报道过的新多态、表明中国人ATP7B基因第16号外星子的突变性质与西方人具有差异性。

内蒙古地区首例Wilson病ATP7B基因突变类型研究

患者男．19岁。因多动、站立不稳等姿势和步态异常3个月来内蒙古医科大学附属医院神经内科门诊治疗，经头部MRI、腹部彩超、铜蓝蛋白以及K-F环的相关检查，证实患者合并有基底节、脑干、肝脏、脾脏、角膜及血液系统的多系统损害；无家族遗传史，参照《实用儿科学》关于威尔逊氏病（Wilson’s disease，WD）诊断标准综合判断为疑似WD。

ATP7B基因治疗对Wilson病小鼠模型肝功能的影响

目的:探讨重组真核表达质粒pcDNA3.0/ATP7B基因治疗对TX小鼠肝功能的影响。方法:TX小鼠18只,随机分为6组,采用质粒和脂质体混合后进行尾静脉注射的方式,分别给予pcDNA3.0/APT7B 0、10、20、50、100、150μg,治疗3 d后测定其肝铜含量,确定最佳治疗剂量。然后选择36只TX小鼠,随机分为生理盐水(NS)组、pcDNA3.0组和pcDNA3.0/ATP7B组,分别以NS、PCDNA3.0、pcDNA3.0/ATP7B进行治疗,于治疗后第0、3、7、14天抽血检测ALT。结果:取100μg为治疗剂量;pcDNA3.0/APT7B组与NS组及pcDNA3.0组比较,于治疗后第3、7、14天ALT显著下降(P<0.05),以第3天下降最明显。结论:ATP7B基因重组真核表达质粒pcDNA3.0/ATP7B对TX小鼠肝功能有改善作用。

肝豆状核变性ATP7B基因启动子区域的分子特征

目的了解中国人肝豆状核变性(WD)ATP7B基因5′UTR及启动因子区域分子特征,探讨不同人种该区域基因多态与突变的分布。方法采用聚合酶链反应-单链构象特异性(PCR-SSCP)和DNA序列分析技术,对110例WD患者和90例健康对照儿童进行ATP7B基因5′UTR及启动因子区域分子特征研究。结果1.共发现5种基因改变:-1294T→G、-105C→G、-116C→T、-132delGCCGC和-75A→C,前三者未见报道,-132delGCCGC未见国内报道。2.-132delGCCGC和-75A→C位点等位基因均占70%以上,发生频率较高,且98%的患者呈完全连锁状态,二者相关性为96.9%。3.国内外ATP7B基因启动子和5′UTR区域至今仅发现约20种多态,包括本课题发现的5种类型。中国人ATP7B基因启动子的多态主要分布于EXON1侧翼序列,其多态的分布和种族密切相关。结论发现ATP7B基因多态5种,其中-1294T→G、-105C→G、-116C→T为首次报道;-132delGCCGC和-75A→C几乎呈连锁存在。中国人WD患者的ATP7B基因启动子和5′UTR结构改变大部分分布在EXON1侧翼序列。中国人启动子部分不存在突变热点。

不同铜源对鸡嗉囊ATP7A和ATP7B基因和蛋白表达的影响

为研究不同水平的硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜对鸡嗉囊铜转运蛋白基因ATP7A和ATP7BmRNA相对表达量及蛋白表达量的影响，将105只1日龄的SPF蛋鸡随机分为7组，每组15只。第1组为对照组，饲喂低铜半纯化日粮；第2组～第4组，在基础日粮中分别以硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜的形式添加铜8mg／kg；第5组一第7组，在基础El粮中分别以硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜的形式添加铜160mg／kg，试验期30d。结果表明，日粮中添加硫酸铜和纳米氧化铜显著提高雏鸡嗉囊铜含量（P〈0．05），微米氧化铜没有明显变化。与硫酸铜和微米氧化铜相比，纳米氧化铜显著提高雏鸡嗉囊ATP7A和ATP7BmRNA和蛋白表达量（P〈0．05）。由此可见，嗉囊ATP7A和ATP7B对纳米氧化铜的转运发挥重要作用。

肝豆状核变性患者ATP7B基因第14外显子突变的研究

目的：研究中国人HLD患者ATP7B基因第14外显子的突变情况。方法：采用PCR－SSCP技术及DNA循环测序法对70例HLD患者及50例健康对照组ATP7B基因第14外显子的多态及突变进行研究。结果：发现第14外显子在两组中均表现为两种SSCP电泳迁移带型，其中以Ⅰ型为多见，在患者组与对照组中出现率分别为88．57％与98％，Ⅱ型在两组中分别为11．43％与2％．但两组间无明显差异（X2＝2．502，P＞0．05）。DNA测序揭示两型在碱基序列上相同，与GENEBANK载录的ATP7B基因第14外显子正常序列完全一致，无突变存在。结果：第14外显子非中国人HLD患者基因突变热点，证实了HLD在不同人种间突变位点存在差异。

人ATP7B基因对Wilson病动物模型LEC大鼠暴发性肝炎的治疗

目的 探讨人ATP7B基因对Wilson病动物模型LEC大鼠暴发性肝炎的治疗效果。 方法 将构建的 7.1kb含有鸡 β肌动蛋白启动子的人正常ATP7BcDNA ,经显微注射法导入人Wilson病动物模型LEC(long EvansCinnamon)大鼠受精卵 ,建立转基因功能恢复大鼠模型。以Westernbolt检测人ATP7B在转基因大鼠肝内的表达 ,用同窝无转基因大鼠及正常野生型LEA大鼠作对照 ,对 6～ 16周龄的转基因大鼠的血清AST、ALT和总胆红素水平进行连续测定 ,同时取 13周龄转基因大鼠的肝组织进行病理学和组织化学分析。 结果 人ATP7B基因在转基因大鼠的肝组织中获得正确和完整的表达 :12周龄前后 ,与同窝无转基因大鼠相比 ,转基因大鼠的血清AST、ALT和总胆红素水平明显降低 ,肝组织的炎性病变显著减轻 ,肝细胞内铜的蓄积减少 ;至 16周龄 ,转基因大鼠的临床表型未见异常 ,存活率达 10 0 %。说明人ATP7B的导入 ,成功地抑制了Wilson病动物模型LEC大鼠的暴发性肝炎的发生。结论 Wilson病肝炎的发生与ATP7B基因功能缺陷引起的铜蓄积有直接关系。基因转移有可能是一种有效的治疗Wilson病的方法。

人ATP7B转基因大鼠模型的建立及其在转基因大鼠体内的表达分析

目的利用受精卵的雄性原核显微注射法,建立人ATP7B转基因大鼠模型。方法将构建7.1kb含有鸡β肌动蛋白启动子的人正常ATP7BcDNA,经显微注射法导入Wilson’s病动物模型LEC(Long-Evans Cinnamon)大鼠的受精卵,利用PCR法筛选、鉴定阳性转基因大鼠,以RT-PCR和Western bolt检测人ATP7B在转基因大鼠体内的表达,并从血液生化指标和临床症状上对16周龄内的阳性转基因大鼠进行分析。结果建立了3株独立的转基因大鼠株系,其中2株转基因大鼠的肝组织中可检测到完整的人ATP7B基因表达产物,血液生化和临床指征显示2株转基因大鼠具有明显的ATP7B相关功能恢复表型。结论人ATP7B在转基因大鼠的肝组织中获得完整和正确的表达,其弥补了转基因大鼠内源性Atp7b基因功能的缺陷。