重组相思子毒素B链蛋白的制备与分析

目的构建、表达和纯化相思子毒素B(ATB)链蛋白并分析其抗原性和毒性。方法运用密码子优化软件优化ATB基因,合成目的基因亚克隆至原核载体p QE-80L构建表达质粒p QE80L-ATB,转化至E.coli M15获得表达工程菌株,并对诱导表达条件和纯化条件进行优化;通过Western blot检测重组蛋白的抗原性;采用人正常肺上皮细胞Beas-2B和胃黏膜细胞GES-1进行重组蛋白的细胞毒性实验。结果 ATB开放阅读框架全长804 bp,编码268个氨基酸残基;表达工程菌株在30℃、1 mmol/L IPTG,3 h后获得包涵体形式表达的目的蛋白,相对分子质量均约为30 000,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后纯度达97%以上,Western blot和MTS实验结果表明,目的蛋白能特异性识别抗相思子毒素多克隆抗体且无毒性。结论重组ATB蛋白实现高表达,具有良好的抗原性,为相关疫苗研究奠定基础。

BALB/c小鼠免疫重组相思子毒素B链蛋白的免疫应答

目的:评价重组相思子毒素B链蛋白(r ATB)免疫雌性BALB/c小鼠的免疫效果,并初步探讨其免疫机制。方法:以r ATB为免疫原,腹腔免疫雌性BALB/c小鼠,间接ELISA方法检测小鼠血清中Ig G、Ig G1、Ig G2a,流式细胞技术检测IFN-γ、IL-4,并进行天然毒素攻毒实验和体外中和实验。结果:血清Ig G、Ig G1效价达到1∶106以上,且攻毒后产生二次免疫应答,与PBS对照组差别有统计学意义(P<0.05);而Ig G2a的血清效价未发生明显变化。细胞因子检测结果表明IFN-γ的表达量与PBS组差异无统计学意义,而IL-4的表达量显著提高(P<0.05)。小鼠攻毒保护实验和体外中和实验结果说明,腹腔注射r ATB可以抵抗最高剂量为5×LD50的天然AT毒素中毒,保护率为100%。结论:r ATB蛋白免疫小鼠后显示出良好的免疫原性,能诱导以Ig G1为主的抗体和Th2优势应答,为候选疫苗的研制奠定基础。

重组相思子毒素B链蛋白冻干保存与免疫效果评价

目的探讨重组相思子毒素B链蛋白(rATB)的冻干保存条件及其免疫雌性Balb/C小鼠后的免疫效果评价。方法 rATB分别与不同冻干保护剂配方混合进行真空冷冻干燥,复融后免疫小鼠4次。每次免疫后,间接ELISA方法检测小鼠血清中IgG效价,四免后采用相思子毒素(abrin toxin,AT)攻毒,并进行小鼠体外中和试验。结果 rATB与10g/L的蔗糖混合保存所测浓度最高,纯度可达98%以上。四免后rATB组血清IgG效价与PBS对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。攻毒保护试验和体外中和试验结果说明,rATB可以抵抗5×LD50的天然AT攻毒。结论 rATB和10g/L蔗糖混合冻干条件下所测定的浓度最高,且冻干蛋白复融后免疫小鼠后显示出良好的免疫原性。

重组相思子毒素B链蛋白免疫原性研究

【目的】评价重组相思子毒素B链蛋白(r ATB)作为相思子毒素疫苗的免疫原性。【方法】以r ATB为免疫原,采用2×2×2×3析因设计方式分别免疫雌性Balb/C小鼠,主因素包括:重组蛋白的剂量、免疫方式、免疫周期、攻毒剂量。每次采用间接ELISA方法检测小鼠血清中Ig G,并进行天然毒素攻毒实验。体外中和实验依据上述所选的免疫方案进行,分析免疫保护效果。【结果】间接ELISA结果表明r ATB蛋白免疫小鼠后血清中能检测到相应的抗AT特异性抗体,Ig G的效价均可达到1:106以上,PBS对照组则没有抗体产生(P<0.05);小鼠攻毒保护实验和体外中和实验结果说明,腹腔注射r ATB在25μg/只的蛋白免疫剂量下,免疫周期为0-14-28-42 d,可以抵抗最高剂量为5×LD50的天然AT毒素中毒,保护率为100%。【结论】r ATB蛋白免疫小鼠后显示出良好的免疫原性,为相关疫苗研究奠定基础。

相思子毒素抗原和抗体制备

〔目的〕研究一种相思子毒素抗原、抗体的制备技术。〔方法〕根据相思子毒素对半乳糖的特异性结合能力,采用亲和层析技术将相思子种子中大部分杂质除去;经凝胶过滤层析,进一步去除植物种子中与蛋白毒素并存的凝集素,获得电泳纯度天然相思子毒素纯品。〔结果〕利用大肠埃希菌表达重组相思子毒素A链蛋白,经金属螯合层析法纯化,得到重组相思子毒素A链蛋白抗原。重组抗原免疫大耳白兔、昆明小鼠,采用辛酸-硫酸铵盐析法和亲和层析法纯化兔血清和鼠腹水获得多抗;2种抗体与天然毒素特异性结合的活性效价均为106。〔结论〕抗原、抗体的制备为建立相思子毒素检测方法奠定了基础。

重组蓖麻毒素与相思子毒素B链嵌合体蛋白的制备与分析

【目的】观察蓖麻毒素(ricin toxin,RT)、相思子毒素(abrin toxin,AT)B链的嵌合体蛋白原核表达并分析其抗原性和毒性。【方法】利用柔性linker-(G4S)3连接两个毒素B链基因(RTB和ATB),优化嵌合体基因RTB-ATB后构建表达质粒p QE80LRTB/ATB,转化至E.coli M15获得表达工程菌株,并对诱导表达条件和纯化条件进行优化;通过Western印迹检测RTB-ATB的抗原性;采用人正常肺上皮细胞Beas-2B和胃黏膜细胞GES-1进行嵌合体蛋白的细胞毒性实验。【结果】RTB-ATB全长1 647bp,编码549个氨基酸残基;E.coli M15在诱导条件为30℃、1 mmol/L IPTG,3 h后获得包涵体形式表达的目的蛋白,相对分子量约为60×103Da,经Ni柱纯化后纯度达98.9%;Western blotting印迹结果表明嵌合体蛋白保持RTB和ATB原有各自的抗原性;MTS实验结果表明目的蛋白无毒性。【结论】嵌合体蛋白RTB-ATB实现高表达,具有良好的抗原性,为研制针对RT和AT的双价疫苗奠定基础。