菠萝AcSERK1启动子的克隆及其初步活性分析

【目的】探讨Ac SERK1启动子的活性,为进一步研究Ac SERK1转录调控的分子机制提供依据。【方法】利用hi TAIL-PCR法从菠萝基因组DNA中分离Ac SERK1启动子序列,并利用Plant Care和PLACE分析该序列的顺式作用元件。将启动子与GUS融合,农杆菌真空渗透法浸染烟草叶片后,光照处理、暗处理和0.5 mg·L^(-1)2,4-D处理36 h后利用组织化学染色法检测GUS活性。【结果】克隆了Ac SERK1上游2097bp启动子序列,命名为P_(Ac SERK1)。预测结果显示,该序列除含有TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子核心元件外,还含有生长素、赤霉素和茉莉酸甲酯等激素响应元件,高温和低温胁迫响应元件以及光响应元件。瞬时表达结果表明,在光和2,4-D的诱导下P_(Ac SERK1)具有启动基因表达的功能。【结论】分离获得了Ac SERK1启动子序列且该启动子在光和2,4-D诱导下能驱动GUS的表达。

菠萝AcSERK15’上游区(-499/+258bp)转录活性的研究

【目的】探究Ac SERK1启动子的功能,有助于了解Ac SERK1的表达调控模式。【方法】以‘神湾’菠萝(Ananas comosus L.‘Shenwan’)为材料,将Ac SERK1启动子缺失序列与GUS融合,构建植物表达载体,并导入根瘤农杆菌GV3101中。利用农杆菌真空渗透法侵染烟草叶片,并检测GUS活性;利用浸染法转化菠萝胚性愈伤组织获得转基因植株,分析光照、2,4-D和4℃等处理后的GUS表达量。【结果】构建2个Ac SERK1启动子植物缺失表达载体,分别命名为p(-30/+258 bp)和p(-499/+258 bp)。烟草瞬时表达结果显示p(-499/+258 bp)表现出强的GUS活性,p(-30/+258 bp)表现出微弱的GUS活性。q RT-PCR结果表明,光照处理后,GUS表达量降低。相反的,2,4-D和4℃处理转基因菠萝植株后GUS表达量均显著增加。【结论】Ac SERK1启动子-499/-30 bp区段内含有光、生长素和低温响应元件。

菠萝AcSERK1启动子的转录起始位点及胚性细胞特异性鉴定

AcSERK1是菠萝(Ananas comosus)体细胞胚发生初期特异表达的基因,为探讨其转录调控规律,对其5′上游调控序列的转录起始位点及启动特性进行了鉴定。采用hiTAIL-PCR技术从菠萝基因组DNA中克隆了AcSERK1完整的5′上游调控序列,利用5′RACE技术鉴定出其转录起始位点位于起始密码子(ATG)上游258 nt(G)处。以AcSERK1 5′上游完整调控序列取代pBI121中的CaMV 35S启动子,构建植物表达载体AcSERK1(–2090/+258)︰︰GUS,并在菠萝不同组织器官中进行瞬时转化分析,发现AcSERK15′上游完整的调控序列(–2090/+258)能够启动GUS在胚性细胞中特异性表达,与AcSERK1表达规律相同,说明该启动子为胚性细胞特异性启动子,对调控外源基因在体细胞胚早期特异表达有重要意义。

菠萝体细胞胚酵母单杂交cDNA文库及AcSERK1启动子相关诱饵载体的构建

为筛选与菠萝AcSERK1启动子中胚性细胞特异性表达调控区段(-983~-881 nt)的结合蛋白,本研究利用MatchmakerTM Gold Yeast One-Hybrid System构建菠萝体细胞胚酵母单杂交cDNA文库以及胚性细胞特异性表达调控区段(SE103)的诱饵载体。建立的菠萝体细胞胚酵母单杂交cDNA文库库容量为1.25×107CFU,其插入片段平均长度约1.5 kb,重组率为100%。通过检测,AbA最低浓度为600 ng/mL时,构建的诱饵载体pAbAi-SE103在Y1HGold酵母菌株中的自激活活性被有效抑制,表明该菠萝体细胞胚酵母单杂交cDNA文库以及诱饵酵母菌株Y1HGold(pAbAi-SE103),可用于AcSRKE1启动子中胚性细胞特异性表达调控区段互作蛋白的筛选实验,为胚性细胞特异性转录因子的分离鉴定提供数据参考。