扇贝多肽经由aSMase-JNK通路抑制UVA诱导HaCaT细胞凋亡

建立紫外线A（UVA）辐射损伤HaCaT细胞的病理模型，从酸性鞘磷脂酶-JNK信号通路的角度研究扇贝多肽（Polypeptide from Chlamys farreri，PCF）抑制UVA诱导HaCaT细胞凋亡的分子机制．采用Hoechst 33258染色结合琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡；用RT—PCR法和细胞免疫荧光染色检测胞内酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，aSMase）的表达；蛋白印迹法检测细胞内JNK及磷酸化JNK的蛋白水平．结果表明，PCF可明显地抑制UVA诱导的HaCaT细胞凋亡；aSMase抑制剂Desipramine和JNK抑制剂SP600125均可阻断UVA引起的细胞凋亡；PCF的浓度在1．42～5．68mmol／L范围内可依赖性地抑制UVA辐射后细胞内aSMase的表达量以及JNK蛋白的磷酸化；预先加入Desipramine则抑制UVA引起的JNK蛋白的磷酸化．表明PCF通过阻断aSMase—JNK通路来抑制UVA诱导HaCaT细胞凋亡．

酸性鞘磷脂酶在瘦素抵抗调控中的应用

瘦素是脂肪细胞分泌的一种激素,在食物摄取和维持体重中具有重要作用,对能量摄入具有负反馈调节作用。目前,已知大多数饮食诱导的肥胖(DIO)个体与瘦素抵抗相关,表现为瘦素敏感性降低和高瘦素血症。酸性鞘磷脂酶(ASM)是催化鞘磷脂水解成神经酰胺的关键酶,在多种疾病的发展中起着关键作用。迄今为止,虽然已有各种研究来解释ASM对各种疾病的致病机制,但是人们对ASM和瘦素抵抗的关系知之甚少。因此,探讨ASM和瘦素抵抗之间的关系可能为瘦素抵抗和瘦素抵抗相关疾病的治疗提供新的策略。

ASM/Cer通路介导模拟失重大鼠股动脉平滑肌细胞增殖与凋亡改变及表型转换

目的探究模拟失重(simulated weightlessness,SW)大鼠股动脉(femoral artery,FA)酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASM)/神经酰胺(ceramide,Cer)通路改变及在FA平滑肌细胞增殖与凋亡改变及表型转换中的作用。方法采用后肢不荷重尾部悬吊(hindlimb unloaded tail suspended,HU)大鼠模拟微重力状态下血流动力学变化,通过蛋白免疫印迹分析、免疫组织化学染色等检测模拟失重大鼠ASM表达量、Cer含量以及血管平滑肌细胞增殖与凋亡及表型的改变。结果与对照(CON)组相比,HU大鼠FA血管平滑肌细胞中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase3)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)的表达量,合成表型标记物(波形蛋白,Vimentin)/收缩表型标记物(α平滑肌肌动蛋白,α-smooth muscle actin,α-SMA)的比值以及ASM和Cer水平均显著升高(P<0.05)。此外,ASM抑制剂地昔帕明(desipramine,Dpm)孵育或盐酸多塞平(doxepin hydrochloride,DOX)灌胃后,HU大鼠FA中Bax的表达水平和Vimentin/α-SMA比值均显著降低(P<0.05)。Dpm孵育后,HU大鼠FA中Bcl-2表达呈上升趋势;DOX灌胃可显著增高HU组大鼠FA中Bcl-2的水平(P<0.05)。结论模拟失重可导致大鼠FA平滑肌细胞的增殖和凋亡水平均显著升高,并由收缩表型向合成表型转换,该重塑过程涉及ASM/Cer通路的过度激活。

酸性鞘磷脂酶对非酒精性脂肪肝病的作用及PPARα-PGC-1α通路的影响

目的观察酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASMase)在高脂诱导小鼠非酒精性脂肪肝病中的作用及对PPARα-PGC-1α通路的调控作用。方法构建基于C57BL/6背景的ASMase敲除小鼠,与野生型小鼠杂交后,获得封闭群杂合子(ASMase^(+/-))用于制备NAFLD模型。实验分4组,野生型正常对照组(WT+Chow)、野生型高脂组(WT+HFD)、ASMase杂合子正常对照组(ASMase^(+/-)+Chow)、ASMase杂合子高脂组(ASMase^(+/-)+HFD)。对照组给予基础饲料饲养12周,高脂组给予高脂饲料饲养12周。实验结束后,生化法检测血清和肝脏脂质水平及肝功能变化;油红染色、HE染色、Masson染色和天狼星红染色分别观察肝脏中脂肪堆积和形态学变化;采用Amplex TM Red Sphingomyelinase试剂盒检测ASMase活性;Western blot检测ASMase、PPARα及其辅激活因子PGC-1α、下游基因CPT1的蛋白表达。结果WT+HFD组小鼠出现高胆固醇血症和肝功能异常,肝脏甘油三酯(TG)水平较WT+Chow组小鼠明显升高(P<0.05或P<0.01),肝细胞出现脂肪变性、空泡样变和肝纤维化,同时肝脏ASMase蛋白表达和活性升高(P<0.01或P<0.001),但CPT1、PPARα和PGC-1α蛋白表达较WT+Chow组无统计学意义;ASMase^(+/-)+HFD组小鼠肝脏TG含量较WT+HFD组明显降低,空泡样变和肝纤维化程度改善,并上调PPARα及其靶基因PGC-1α和CPT1的蛋白表达。结论ASMase促进肝脂肪变性和肝纤维化,可能与其抑制PPARα-PGC-1α通路有关。

酸性鞘磷脂酶和铁死亡在乳腺癌中的研究进展

女性乳腺癌发病率已经超过肺癌成为最常见的恶性肿瘤,2020年的数据显示女性乳腺癌发病人数230万,占癌症新发病例的11.7%[1]。乳腺癌的高发病率导致其全球负担越来越严峻,乳腺癌的发病率和死亡率在发展中国家呈快速上升趋势[2]。乳腺癌疾病负担及其次生社会问题急待解决,尤其在年轻乳腺癌患者中尤为突出。年轻乳腺癌患者(年龄<40岁)需面对如生育、生殖器官功能的保留等特定的社会问题。加之年轻乳腺癌患者有不同的风险因素、临床特点及肿瘤生物学特征[3].

酸性鞘磷脂酶/神经酰胺通路在神经系统疾病中的研究进展

研究表明酸性鞘磷脂酶/神经酰胺(ASMase/Cer)通路可介导细胞免疫调节、炎症、凋亡等细胞活动,与多种神经系统疾病,如缺血性脑卒中、阿尔兹海默病、a-突触核蛋白病等的发生、发展密切相关,ASMase/Cer通路有可能成为它们治疗的靶点。本文综述了ASMase/Cer通路在缺血性脑卒中、阿尔兹海默病、a-突触核蛋白病等神经系统疾病的生物学功能及调节机制的最新研究进展。

尼曼-匹克病SMPD1基因突变分析

目的探讨中国人尼曼-匹克病(NPD)家系发病的分子遗传学基础及SMPD1基因检测在中国人NPD家系基因诊断中的意义。方法收集3个无关的NPD家系的临床资料和血液标本,同时选取20例健康儿童的血液标本。从外周血提取基因组DNA,经聚合酶链反应(PCR)依次扩增3个家系中所有成员SMPD1基因的6个编码外显子及其侧翼内含子序列,扩增产物纯化后直接进行正反向测序,并与Genebank进行比对;将发现突变所在外显子的扩增产物通过TA克隆技术进一步证实突变的实际意义。结果家系1先证者为T107C的纯合突变,其父母均为T107C的杂合突变;家系2和家系3的所有成员均发现在SMPD1基因外显子1上有连续6个碱基缺失,即在编码序列第108碱基至第113碱基GCTGGC的缺失(c.108-113del GCTGGC),且均为纯合突变。进一步应用TA克隆技术检测,家系2和家系3的所有成员随机挑选的单克隆测序结果均存在该突变c.108-113del GCTGGC。对20个正常对照的PCR扩增产物进行直接正反向测序,均未见以上突变。结论 SMPD1基因第1外显子上T107C的纯合突变为家系1先证者发病的分子遗传学基础,其父母是表型正常的基因突变携带者。家系2和家系3所有成员均发现在SMPD1基因第1外显子上存在c.108-113del GCTGGC的纯合突变,考虑为人类基因多态性。

地昔帕明对兔动脉斑块细胞凋亡及内质网应激的影响

目的观察地昔帕明(DES)对动脉粥样硬化(AS)模型兔斑块内细胞凋亡及内质网应激的影响。方法腹主动脉球囊损伤及高脂饲料喂养12周建立兔AS模型,最后4周随机分为AS和AS+DES组,同时设立普通饲料喂养的正常对照(NC)组和DES组,DES剂量为4 mg·kg^(-1)·d^(-1),对照组以生理盐水代替灌胃治疗。12周末,观察各组兔血清血脂水平,UPLC法测定血浆及主动脉酸性鞘磷脂酶(ASM)和神经酰胺含量,TUNEL染色测定凋亡细胞,Western blot检测GRP78和CHOP蛋白表达。结果 DES干预对正常兔和AS模型兔的TG、TC、HDL-C、LDL-C、ox-LDL水平无明显影响,但可降低血浆和主动脉ASM、神经酰胺含量及腹主动脉斑块凋亡细胞数量,下调斑块组织的GRP78和CHOP蛋白表达。结论 DES可通过抑制ASM活性,下调神经酰胺水平,改善内质网应激,从而减少AS斑块内的细胞凋亡,缓解AS斑块形成。

酸性鞘磷脂水解酶和MAPK信号通路在UVA诱导细胞凋亡中的作用

为了探讨酸性鞘磷脂水解酶 (ASM)和MAPK信号通路在UVA诱导的细胞凋亡中的作用 ,用DNA梯形条带 (DNAladder)和荧光显微镜鉴定细胞凋亡 ,Western印迹分析MAPK信号通路的激活情况 .结果显示 :①经UVA照射 ,正常的淋巴母细胞JY出现严重的细胞凋亡 ,而ASM遗传性缺陷的淋巴母细胞MS1 4 1 8出现轻微凋亡 ;给予ASM特异性抑制剂NB6 ,UVA诱导的JY细胞凋亡明显减轻 ,表明UVA诱导的细胞凋亡依赖于ASM .②UVA照射后 ,磷酸化ERK含量在MS1 4 1 8细胞中明显升高 ,在JY细胞中受到抑制 ;UVA照射前给予NB6 ,JY细胞中磷酸化ERK含量上升 ,表明ASM能抑制ERK的激活 .③UVA照射后 ,磷酸化JNK含量在MS1 4 1 8细胞中几乎没有变化 ,而在JY细胞中含量升高 ;UVA照射前给予NB6 ,JY细胞中磷酸化JNK含量没有明显升高 ,表明ASM激活JNK通路 .④NB6对UVA激活的p38MAPK信号通路没有影响 ,表明p38的激活与ASM关系不大 .研究表明 ,UVA诱导的细胞凋亡是通过激活ASM。

百草枯所致小鼠肺纤维化时肺组织酸性鞘磷脂酶表达上调

目的:观察百草枯所致C57BL/6小鼠肺纤维化时肺组织酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASM)的表达变化,初步探讨ASM在百草枯所致肺纤维化发生发展中的潜在病理意义。方法:将20只C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组和百草枯组,百草枯组动物腹腔注射20 mg/kg百草枯,对照组动物注射等体积生理盐水,单次注射百草枯21 d后麻醉动物进行支气管肺泡灌洗,取支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid,BALF)检测灌洗液中细胞总数、总蛋白浓度,ELISA法检测BALF中IL-6和TNF-α水平;取肺组织,HE染色和Masson染色观察组织形态学变化和胶原沉积,TUNEL染色和Caspase-3活性检测细胞凋亡情况,DHE染色检测活性氧(reactive oxtgen species,ROS)水平,Real time PCR、免疫组织化学、Western Blot检测肺组织中ASM mRNA和蛋白表达。结果:用百草枯处理后,C57BL/6小鼠肺组织肺泡排列紊乱、部分肺泡出现塌陷、肺泡间隔增厚、炎性细胞浸润,肺组织中出现大量胶原沉积。与对照组相比,百草枯组小鼠BALF中细胞总数增多(P<0.01),总蛋白浓度增加(P<0.01),IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05);肺组织中TUNEL染色阳性细胞数增多(P<0.01),Caspase-3活性增加(P<0.05),ROS水平升高,ASM mRNA和蛋白表达上调(P<0.05)。结论:ASM可能参与百草枯所致肺纤维化的病理生理过程,其具体作用机制有待进一步研究证实。

小鼠模型中神经酰胺对血小板介导的输血相关急性肺损伤的作用

目的评价老化的血小板中的神经酰胺对输血相关急性肺损伤(transfusion-related acute lung injury,TRALI)的作用机制。方法通过脂多糖预刺激,随后输注10 m L/kg储存1~5 d的血小板,在BALB/c小鼠体内构建TRALI的二次打击模型。采用酸性鞘磷脂酶特异性抑制剂ARC39或输注来自酸性鞘磷脂酶缺乏小鼠的血小板对TRAIL模型小鼠进行干预,评价不同时间点小鼠血小板中鞘磷脂成分,以及TRAIL模型小鼠肺中性粒细胞积聚情况,内皮屏障功能,肺组织病理学损伤程度。结果存储1~5 d的血小板输注到脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)预刺激后的C57/B6小鼠体内能够引起肺组织的特征性损伤,且损伤严重程度随血小板储存时间的增加而加剧。血小板中的神经酰胺在储存过程中不断积累和释放。与对照组相比,输注ARC39预处理后的血小板或酸性鞘磷脂酶缺乏的血小板可明显缓解肺组织的损伤。结论老化的血小板会导致小鼠发生TRALI,但这种损伤可以通过酸性鞘磷脂酶抑制剂或特异性敲除酸性鞘磷脂酶基因来逆转和治疗,针对鞘脂形成的干预措施有望成为增加血制品存储安全性和寿命的有效策略。

熊脱氧胆酸对小鼠结肠癌抑制作用及机制

目的探讨熊脱氧胆酸(UDCA)对1,2-二甲肼(DMH)所致小鼠结肠癌抑制作用及可能机制。方法ICR小鼠喂养1周后,按体重随机分为3组,其中2组腹腔注射DMH,剂量30mg/(kg.bw),每周1次,连续6周诱导结肠癌模型,另一组为空白对照组。从第7周开始在一组(UDCA组)饲料中添加UDCA,剂量3g/kg;另一组(DMH组)饮食不做处理。所有各组均喂食标准AIN-93饲料,28周后处死小鼠,取结肠粘膜进行小鼠碱性鞘磷脂酶(alk-SMase)的活性表达分析。结果与DMH组相比,给予UDCA组小鼠结肠肿瘤数目明显减少(t=2.77,P<0.05),病理检查肿瘤恶性程度也显著低于DMH组;alk-SMase活性检测中,UDCA组结肠粘膜及内容物alk-SMase活性分别为22.56%和28.97%,其中结肠内容物活性UDCA组比DMH组提高了近14倍;蛋白免疫印迹试验时,UDCA组alk-SMase蛋白表达明显强于DMH组。结论UDCA对DMH所致小鼠结肠癌有抑制作用,其可能的机制是通过上调小鼠结肠粘膜alk-SMase活性及表达。

酸性鞘磷脂酶活化在微波辐照致神经细胞凋亡中的作用研究

为阐明微波辐照致神经细胞酸性鞘磷脂酶(Acid Sphingomyelinase,ASM)活化的规律,揭示ASM活化在微波辐照致神经细胞凋亡中的作用,以原代培养神经元细胞,采用30W/cm2微波辐照10min,采用Hoechst 33342荧光染色观察细胞凋亡,以ASM活性测定试剂盒测定ASM活性,RT-PCR、western blot分别检测ASM基因和蛋白表达的变化。用ASM活性抑制剂米帕明预处理,观察微波辐照后神经细胞凋亡情况。研究发现,微波辐照引起海马神经元细胞发生凋亡,神经元ASM mRNA和蛋白表达上调,ASM酶活性增高,给予ASM活性抑制剂米帕明预处理后,可部分拮抗微波辐照引起的神经细胞凋亡率增加。结果提示,微波辐照引起神经细胞ASM活化及表达上升,ASM活化在微波辐照所致的神经细胞凋亡中起重要作用。

微生物来源酸性鞘磷脂酶抑制剂NF-0265A的研究

目的筛选信号转导相关疾病中重要靶点-酸性鞘磷脂酶抑制剂。方法使用ODS柱色谱,制备TLC和SephadexLH-20色谱等方法进行化合物的分离纯化,利用紫外、质谱等理化分析以及核磁共振等分析方法进行结构解析,利用酸性和中性SMase的活性测定方法进行活性评价。结果从微生物代谢产物的菌种中,筛选得到一个活性化合物NF-0265A,其对酸性SMase的IC50为68.7μmol·L-1。对中性SMase的活性测定的结果表明,此物质在200μmol·L-1的浓度下未见抑制作用,此化合物的化学结构与TAN-1446A的甲醇加成物相同。结论NF-0265A为第一个微生物来源的酸性SMase特异性的抑制剂,该化合物在信号转导系统和免疫系统的活性尚未见报道。

酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3b在足细胞损伤相关肾病中的研究进展

足细胞在维持肾小球滤过屏障的结构和功能方面发挥重要作用,足细胞损伤可导致临床蛋白尿的发生、肾小球硬化及肾功能损害。酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3b(SMPDL3b)是足细胞膜上与鞘磷脂代谢相关的糖基磷脂酰肌醇锚定酶,是足细胞功能的重要调节因子,可通过与可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体相互作用,影响整合素活性,导致足细胞表型转变;还与糖尿病肾病胰岛素受体信号通路密切相关,在多种蛋白尿相关性肾脏疾病发病机制中起重要作用。通过稳定体内SMPDL3b水平调控脂类代谢可能成为足细胞相关肾病定向治疗的新靶点。

酸性神经鞘磷脂酶的生物学特性及其功能

神经鞘磷脂酶(SMase)可水解鞘磷脂产生神经酰胺,在人体内发挥重要作用。酸性神经鞘磷脂酶(ASMase)作为SMase最重要的一个亚型,在辐射诱导细胞凋亡、调节肿瘤细胞生长、参与Fas信号系统传递等方面均可发挥重要作用。

ASM在免疫调节及自身免疫性疾病中的研究进展

酸性鞘磷脂酶(ASM)通过水解鞘磷脂生成神经酰胺,神经酰胺通过重组给定的信号体,在细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡、调节免疫及参与应激反应等方面发挥诸多功能。ASM/神经酰胺通路参与免疫细胞在体内的功能调节,进而参与肿瘤、急慢性炎症和自身免疫性疾病的发病和发展。本文将对ASM/神经酰胺通路在代谢途径、固有及获得性免疫细胞调节和自身免疫性疾病中的作用等方面进行综述。

丁酸盐通过调控酸性鞘磷脂酶缓解烫伤诱导的T细胞损失的小鼠实验研究

目的探讨丁酸盐调控烫伤诱导的T细胞变化的作用机制。方法将小鼠随机分为3组:对照组(腹腔注射灭菌的生理盐水1. 5 ml)、烫伤组(烫伤模型)和丁酸组(烫伤模型+腹腔注射1 g/kg的丁酸注射)。采用高效液相色谱于烫伤模型建立后第1、2、3、4、5、6、7和8天检测对照组和烫伤组小鼠粪便中丁酸盐浓度。平板培养法检测3组中肠道菌群,试剂盒法检测酸性鞘磷脂酶(Asm)活性,流式细胞术检测T淋巴细胞各细胞亚型的表达。采用Ficoll-Paque梯度离心法从小鼠脾脏中分离T淋巴细胞。将细胞分为3组:对照组(不处理)、Asm抑制组(10μM的Asm抑制剂地昔帕明)和Asm抑制+丁酸组(Asm抑制剂+100μM的丁酸),检测各组细胞中Asm活性及T淋巴细胞各细胞亚型的表达。结果与对照组相比,烫伤后第3、5、6、7和8天小鼠粪便中丁酸浓度均显著降低(P <0. 05)。丁酸盐可显著增加烫伤后小鼠粪便中乳酸杆菌属、双歧杆菌属、普拉梭菌和罗氏菌属的含量(P <0. 05),降低硫酸盐还原菌的含量(P <0. 05)。丁酸盐可促进烫伤后Asm激活,增加烫伤后脾脏CD4 T细胞、CD4初始T细胞、CD8 T细胞及CD8初始T细胞的数量(P <0. 05)。Asm抑制组中Asm的活性显著低于对照组,而Asm抑制+丁酸组高于Asm抑制组(P <0. 05)。Asm抑制组CD4 T细胞、CD4初始T细胞、CD8 T细胞及CD8初始T细胞的数量均低于对照组,而Asm抑制+丁酸组高于Asm抑制组(P <0. 05)。结论丁酸盐可通过激活Asm修复烫伤诱导的肠道菌群失衡,缓解烫伤诱导的T细胞丢失。

石榴花多酚改善糖尿病大鼠肾损伤的机制研究

目的探讨石榴花多酚对糖尿病肾损伤的作用及其可能的机制。方法40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、石榴花多酚组和地昔帕明组各10只,高脂饲料饲喂联合链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导建立糖尿病大鼠模型。检测大鼠血糖、尿素氮(BUN)、血肌酐(S-Cr)和24 h尿蛋白含量,PAS染色和Masson染色观察大鼠肾脏病理学变化,TUNEL染色检测大鼠肾细胞凋亡率,免疫组化和RT-PCR检测大鼠GRP78和CHOP表达水平,Western blot检测酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASMase)蛋白表达水平。结果与模型组比较,石榴花多酚组和地昔帕明组大鼠血糖水平、BUN、S-Cr、24 h尿蛋白含量和肾细胞凋亡率显著降低,肾小球体积、GRP78、CHOP和ASMase表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。显微镜下观察,与模型组比较,石榴花多酚组和地昔帕明组大鼠的肾组织病理学损伤明显改善,胶原纤维沉积减少。结论石榴花多酚通过抑制酸性神经鞘磷脂酶和内质网应激改善大鼠糖尿病肾损伤。

丙咪嗪经酸性鞘磷脂酶/神经酰胺通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NLRP3炎症小体的激活

目的研究丙咪嗪对脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)NLRP3炎症小体激活的影响并探讨其可能的作用机制。方法 CCK-8检测丙咪嗪对RAW264.7细胞活性的影响;用不同浓度丙咪嗪预先处理RAW264.7细胞2 h后再用LPS处理细胞8 h,Western blot法检测酸性鞘磷脂酶(ASM)、NLRP3、caspase-1、白细胞介素(IL)-1β和IL-18的蛋白表达水平;细胞免疫荧光法检测神经酰胺(Cer)的含量变化;ELISA法检测炎性因子IL-1β和IL-18的释放水平。结果与对照组相比,LPS(1 mg/L)能增加RAW264.7细胞ASM的蛋白表达和Cer的含量(P<0.01);上调细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表达水平以及细胞上清液IL-1β和IL-18的释放水平(P<0.01)。而经丙咪嗪预先处理能够显著抑制LPS所致ASM和Cer的改变(P<0.01);可明显抑制细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表达以及细胞上清液中IL-1β和IL-18的释放(P<0.05,P<0.01)。结论丙咪嗪可通过调控ASM/Cer通路,抑制NLRP3炎症小体的激活从而发挥抗炎活性。