细菌性果斑病菌Acidovorax avenae subsp.citrulli对黄瓜侵染及离体叶片接种方法的研究

由Acidovorax avenaesubsp.citrulli引起的细菌性果斑病对西瓜、甜瓜等葫芦科作物是一种毁灭性病害。对分离自发病甜瓜的细菌性果斑病菌供试菌株FC440的抗生素抗性特点、对黄瓜(Cucumis sativus L.)的致病性以及黄瓜离体叶片接种发病条件等病原生物学特性作了研究。结果表明:FC440对氨苄青霉素,氯霉素,壮观霉素,利福平和潮霉素具有抗性,对卡那霉素和四环素敏感,可侵染重要的经济作物黄瓜。离体叶片接种实验显示,不同缓冲液制备的菌悬液在供试黄瓜叶片上形成病斑存在差异,磷酸盐缓冲液(5和10 mmoL/L PBS)悬浮菌液发病较水悬浮菌液快,104cfu PBS悬浮菌的接种量和107cfu水悬浮菌的接种量分别可致黄瓜离体叶片在接种8 d内形成典型症状;病斑在划伤条件下以及在老龄叶片上形成快;以5 mmoL/L PBS(pH 7.4)悬浮,106cfu的接菌量划伤接种第一、二真叶期叶片,是离体黄瓜叶片上形成病斑的较好的接种方法。这些研究结果为利用该菌的抗生素抗性特点开展其遗传转化工作、离体接种以便规模筛选致病突变体以及研究其与寄主植物互作机制等方面的工作奠定了基础。

Acidovorax avenae subsp.Citrulli危害新寄主籽瓜和病菌的快速检测(英文)

根据病原菌的生物学特性、生理生化特性包括革兰氏染色反应、氧化酶反应、过氧化氢酶反应、氧需求等和特异性PCR扩增结果,以及病原菌危害造成的田间症状,发现燕麦嗜酸菌属西瓜亚种(Acidovoraxavenaesubsp.Citrulli)可在新寄主-籽瓜上造成严重危害。该病菌在田间主要侵染籽瓜的果实和子叶,症状在果实上尤为明显,形成黑色的星状开裂。为了控制该病的发生,对种子携带病原菌的快速检测方法进行了研究。结果表明,特异性PCR作为检测种传病原菌具有快速、准确和灵敏的特点。当种子浸出液为PCR反应的模板时,可检测出的种子带菌率极限最低为4%;当以种子浸出液提取的DNA为模板时,种子带菌率检测极限为2%甚至更低。

福建省西瓜细菌性果斑病的病原鉴定

2004年在福建种植的西瓜上发现一种新细菌病害———西瓜细菌性果斑病.从病叶和病果上分离到20个细菌菌株,接种西瓜后,发病症状与自然发病症状完全一致,而且从接种病株上又重新分离到了相同细菌,这20个细菌菌株经柯赫氏法则证明均为该病的致病菌.各菌株间致病力无明显差异.挑选其中的14个菌株经革兰氏染色、菌体形态、培养性状、生理生化特性等测试,确认该病原菌为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenaesubsp.citrulli).该病菌除侵染西瓜外,人工接种尚能侵染多种葫芦科及番茄、玉米、大豆等作物.

哈密瓜细菌性果斑病种子带菌的PCR检测

利用特异性引物PCR技术,用水或PBST浸提哈密瓜带菌种子中的病原物,浸提液直接作模板就可以扩增出特异性的条带,检测出瓜类果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli)的种子带菌情况,种子的浸提时间对检测结果的影响不大,同时查明种皮是种子带菌的主要部位;病瓜种子只有在2粒以上才能检测。采用PCR技术对市售的11个哈密瓜品种的种子带菌情况进行检测,结果检测出8个品种携带瓜类果斑病菌,进一步说明这一方法的可行性和实用性。

哈密瓜细菌性果斑病病原菌鉴定

20 0 0年在内蒙古和新疆的哈密瓜上发现一种新细菌病害—哈密瓜细菌性果斑病 ,从病叶和病果上分离到 33个细菌菌株 ,接种哈密瓜、西瓜和甜瓜后 ,发病症状与自然发病症状完全一致 ,而且从接种病株上又重新分离到了此病原细菌 ,这 33个细菌菌株经柯赫法则证明均为该病的致病菌。各菌株致病力无明显差异。经革兰氏染色反应、菌体形态、培养性状、生理生化反应、细胞化学成分分析(糖、蛋白质、氨基酸、脂肪酸、mol% G+ C)、DNA- DNA杂交 ,确认该病原菌为燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al. 1992 ) =类产碱假单胞菌西瓜亚种 (Pseudomonaspseudoalcaligenes subsp.citrulli Schaad et al.1978)。该病菌除侵染哈密瓜外 ,人工接种尚能侵染多种葫芦科及番茄。

一种DNA染料结合聚合酶链反应检测鉴别植物病原细菌死活细胞

建立了一种将DNA染料(EMA)结合PCR的新分析方法,用于有效检测区分植物病原细菌死活细胞.结果表明,当用2.0 mg/L或更高浓度的EMA渗透处理含有106cfu/mL的死细胞菌悬液后再曝光处理10 min,其PCR结果呈阴性,而未经过EMA渗透处理的对应样品PCR结果呈阳性;EMA渗透处理含有适当数量病菌活细胞的种子浸泡液后,更有助于特异性检测混合体系中靶标菌活细胞.分析认为,该方法避免了传统PCR无法区分细菌死活细胞的弊端,是一种快速、灵敏且能有效鉴别病原细菌死活细胞的新方法.

不同哈密瓜品种苗期对细菌性果斑病的抗病性鉴定

为探明新疆哈密瓜不同品种对瓜类细菌性果斑病(Acidovorax avenae subsp.citrulli)的抗性差异,提供筛选抗耐病性材料的新来源,通过室内喷雾接种法,对30个哈密瓜主栽品种和后备品种(系)进行了苗期抗病性鉴定,结果表明:新金雪莲为高抗品种,病情指数为2.73;新密25号等12个为中抗品种;新密杂7号等12个为中感品种;金凤凰等5个为高感品种,最高病情指数为52.30;没有免疫品种。

免疫凝聚试纸条和TaqMan探针实时荧光PCR检测西瓜细菌性果斑病菌比较研究

以西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp．citrulli）菌悬液和田间采集的病组织为试材，研究了免疫凝聚试纸条和实时荧光PCR技术检测的灵敏度和适应性。结果表明，免疫凝聚试纸条检测灵敏度为10^6 cfu／mL，具有简便、快速、易操作特点，适用于田间快速检测和病害诊断；TaqMan探针实时荧光PCR检测灵敏度达10^3～4 cfu／mL，比传统PCR检测灵敏度（10^5 cfu／mL）提高了10～100倍，且不需要琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色和Southern杂交。但需要昂贵的仪器和试剂，适用于室内检测及相关研究。

水稻细菌性褐条病病原的鉴定

为明确从褐条病稻苗上分离出来的病原细菌并与西瓜果斑病菌相区分,对该病原特性进行了研究。分离获得6株褐条病致病菌,其中4株经主要细菌学特性、菌落形态、致病性、Biolog、脂肪酸分析(FAME)、电镜观察、Nested-PCR鉴定及与3株水稻细菌性褐条病标准菌株和2株西瓜果斑病标准菌株的比较,证实了该病是由单极鞭革兰氏阴性细菌Aci-dovorax avenae ssp.avenae引起的。FAME将水稻细菌性褐条病菌误鉴定为西瓜果斑病菌,而用Biolog和nested-PCR鉴定能得到准确的鉴定结果。

瓜类细菌性果斑病菌tvrR基因的克隆及其对致病性的影响

根据丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)DC3000中新的毒性基因tvrR(TetR-like viru-lence regulator)的氨基酸序列,从瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)的全基因组中发现并克隆了tvrR基因的同源物。通过同源重组的方法,构建了tvrR基因的插入突变体,并且经过PCR及Southern杂交验证确认。突变体和野生型一样可以激发烟草过敏反应。致病性试验结果显示:突变体比野生型的病程延长,但最终致病情况与野生型无差异。接种的寄主组织中菌体生长能力检测发现,突变体的繁殖速度慢于野生型,但最终其菌体数量也能达到野生型菌株的最大值。在营养丰富的LB培养基和营养贫乏的MMX基本培养基中生长测定均发现,突变体生长速度慢于野生型,但最终也能达到野生型的最大生长量。瓜类细菌性果斑病菌tvrR基因突变体致病性的改变与其生长能力变化的一致性表明,其致病性的变化是由于其生长能力的改变引起的。

西瓜细菌性果斑病菌的16S rDNA序列分析及特异性引物的设计

利用细菌16S rDNA基因的通用引物对16个供试菌株进行PCR扩增,把扩增产物进行核苷酸序列测定。将获得的序列与GenBank中相关菌株的16S rDNA序列进行同源性分析。以此设计出检测A.a.c的特异性引物,并利用最大简约法构建了16S rDNA系统演化树。系统演化关系分析表明,6～9号供试菌株的16S rDNA序列与A.a.c标准菌株仅有3个位点的差异,其同源性均在99.8%以上,在构建的系统演化树上,它们聚为同一个族群。利用设计的一对特异性引物(BFB64/65),对各供试菌株进行PCR检测,结果只有A.a.c相关菌株产生扩增条带,产物大小与预期一致。

籽用西瓜种质资源对细菌性果斑病的抗性鉴定

【目的】通过对62份来源于籽用西瓜、国外引进的粘籽西瓜及普通西瓜杂交后代的自交纯系进行苗期抗病性鉴定,以此来探明籽用西瓜种质资源对瓜类细菌性果斑病的抗病性差异。【方法】通过室内人工接种法。【结果】筛选出了ES84、ES90等22份中抗材料;ES30、ES94等22份中感材料;ES46、ES50等18份高感材料,没有高抗和免疫材料。【结论】目前新疆主栽品种民籽1号、民勤大片表现中感,内蒙古黑中片、黑丰、安徽黑小片表现为感病。筛选出的中抗材料ES84、ES90、ES30等均含有粘籽西瓜的抗性基因。

免疫检测试纸条法检测西瓜子中的瓜类果斑病菌

将西瓜子进行表面消毒后破碎,用无菌水于4℃浸泡4h,取300μL浸提液加入250mL细菌液体培养基中,28℃150r/min培养3d,取培养液0.7mL与Agdia公司提供的瓜类果斑病菌检测试纸条样品浸提网袋中的缓冲液混匀,取混合液1mL用于免疫检测试纸条检测。该方法可有效检测出西瓜子中是否带有瓜类果斑病菌(Acidovorax avenaesub sp.citrulli(Schaadet al.)Willems et al.)。

西瓜细菌性果斑病菌Taq Man探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

根据西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenaesubsp.citrulli)与相关细菌16S rDNA序列差异,设计出对西瓜细菌性果斑病菌具有稳定点突变特异性探针Aac-probe,利用该探针对23种供试菌株进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明,只有西瓜细菌性果斑病菌能检测到荧光增强信号,其它细菌无荧光增强信号。该方法特异性强,灵敏度高,重复性好,可有效地应用于西瓜细菌性果斑病菌的检测。

不同哈密瓜品种对细菌性果斑病抗病性及发展动态的研究

为明确不同哈密瓜品种对果斑病的抗病能力,采用人工接种和田间自然发病2种方法测定了13个哈密瓜不同品种对细菌性果斑病的抗病性。结果表明,供试的13个哈密瓜品种对细菌性果斑病的抗病性存在显著的差异,其中超早丰F1为高抗品种,华夏密宝、甘密宝、西域甘露IIF1、红脆宝、泰丰密和玉金香为中抗品种,骄密二号、早皇后、金龙花为中感品种,新密杂十一号、新密雅7号、金8_4为感病品种,没有对果斑病完全免疫的品种。通过田间发病情况系统调查分析得知,生产中感病品种发病早,病情发展速度快,病情指数高;抗病品种发病晚,病情发展缓慢,病情指数低。

西瓜果腐病种子带菌的PCR检测研究

基于传统的PCR检测技术,研究了西瓜果腐病种子带菌的PCR检测方法。结果表明,磷酸缓冲液更适合于作为带菌种子的浸提液,PVPP可去除种子残留物,提高检测的灵敏度。使用本检测方法,摇培时间在2h以上时,其时间的长短不影响自然感染带菌种子的检测;能检测到的西瓜种子最低带菌率为1‰,即1000粒种子中存在1粒带菌的种子;而且能对自然感染的单粒种子进行检测,得到种子样品带菌率的数据。本研究所获得的检测方法简便实用,能有效应用于西瓜商品种子西瓜果腐病菌的检测。

西瓜细菌性果斑病拮抗内生细菌的分离和筛选

从葫芦科作物及空心菜的叶片、茎及花上共分离到95个菌株,采用抑菌圈法共筛选到对西瓜细菌性果斑病病原菌具有不同程度拮抗作用的菌株46株,占分离菌株总数的48.4%;从拮抗菌株中筛选出5株对西瓜细菌性果斑病菌具有较好拮抗效果的菌株,其对西瓜细菌性果斑病的防治效果为68.75%-93.24%.内生性测定结果表明这5株菌株均能在西瓜体内定殖,5株菌株经过革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色和一些生理生化测定,初步被确定为芽孢杆菌属(Bacillus spp.).

打瓜细菌性果斑病品种抗性鉴定及药剂筛选研究

通过人工接种的方法,对"红大片"、"红小片"、"新籽一号"、"民籽一号"、"黑丰大板"和"内蒙黑中片"6个打瓜品种进行打瓜细菌性果斑病的抗性鉴定。结果表明:"黑丰大板"、"内蒙黑中片"的抗性较强,属于中抗品种;"新籽一号"、"民籽一号"属于中感品种;"红大片"、"红小片"抗性较差,属于感病品种,未发现高抗或免疫品种;用9种杀菌剂对打瓜细菌性果斑病进行了室内、盆栽防治试验,所有供试药剂对该种病害防治效果都不理想,其中较好的为53%氢氧化铜粉剂1.5g/L,防治效果为54.6%。

哈密瓜细菌性果斑病菌群体感应系统的检测

本文利用群体感应信号报告菌Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4),在LB报告平板上对燕麦食酸菌西瓜亚种的19个菌株进行了初步检测,发现18个菌株有群体感应信号产生。用琼脂条法对菌株Pslb-94进一步检测,证实菌株Pslb-94存在群体感应系统。提取了该菌株信号物质,反相薄层层析(TLC)检测证明该菌株能产生群体感应信号分子。

进境兰花褐斑病菌的分离及PCR鉴定

兰花褐斑病(Acidovorax avenae subsp.cattleyae)是兰花上一种很重要的细菌性病害。在检疫监管中,对进境文心兰(Oncidiums spp.)疑似兰花褐斑病症状的植株分离所得细菌进行过敏性坏死反应、生理生化反应的基础上,利用特异性引物和ITS通用引物进行了PCR扩增及序列分析,确认该病害为A.avenae subsp.cattleyae。此为我国首次从进境兰花中截获兰花褐斑病菌。