胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因在不同宿主系统中的表达及密码子偏好性分析

用PCR方法从胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型参考株APP259的基因组DNA中,扩增了约954 bp的apxⅠA基因片段,分别构建了大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1/apxⅠA和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apxⅠA。对目的基因密码子偏好性进行了分析,发现其中有4个大肠杆菌稀有密码子,占1.2%;有49个毕赤酵母稀有密码子,占15.4%。利用所构建的大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1/apxⅠA和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apxⅠA分别进行表达。结果显示,目的基因在大肠杆菌中能以包涵体形式进行高效表达,其融合蛋白占菌体总蛋白的32%;在毕赤酵母中则以较低水平分泌表达至培养基的上清液中,40倍浓缩后方能检测到少量目的蛋白。证实,目的基因序列中的密码子偏好性影响其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达。

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

以猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清10型标准株ApxⅠ天然外毒素为免疫抗原,接种Balb/c小鼠;设计编码ApxⅠN-端具有保护性抗原表位apxⅠA基因(1 149bp)的引物,构建原核表达载体pET-32a-apxⅠA,转化至E.coli BL21,获得分子质量约为41ku的rApxⅠA作为包被抗原,用间接ELISA方法筛选单克隆融合细胞上清,共获得2株稳定分泌抗ApxⅠA蛋白mAb的杂交瘤细胞系,亚类鉴定分别为IgG3、IgG2a,2株mAb能特异性地识别ApxⅠA蛋白,为ApxⅠA诊断试剂的研究奠定了基础。

猪胸膜肺炎放线杆菌致病性生物Ⅰ型PCR诊断方法的建立

根据已发表的猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）apxⅣ毒素基因序列的保守区域设计1对特异性引物，建立检测致病性APP1～12血清型标准菌株的PCR方法。在双盲试验中，血清1型（2株）、3型、5型和7型临床分离株与致病性APP1～12血清型标准菌株一样，均能扩增出预期大小为876bp的apxⅣ片段，可检出最低活菌数为2×10^2cfu·mL^-1，最低检出DNA含量为9pg·μL。检测疑似传染性胸膜肺炎感染猪的10份病变肺组织样品，阳性6份，与细菌分离鉴定结果一致。而副猪嗜血杆菌1～15型（缺失8型）、猪放线杆菌、猪源多杀性巴氏杆菌、猪霍乱沙门氏菌、奇异变形杆菌、猪源支气管败血波氏菌、猪丹毒杆菌的PCR检测结果都为阴性。结果表明：该PCR方法可用于致病性APP生物Ⅰ型的快速特异性检测和诊断。

胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅠBD基因特异性片段的克隆及表达

以胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型标准菌株基因组为模板,用PCR扩增ApxⅠBD基因的特异性片段;对PCR产物纯化回收后与载体pMD 18-T进行连接、转化,经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pETⅠBD;转入大肠埃希氏菌BL21中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳。结果,从APP中克隆的ApxⅠBD DNA序列与已发表序列的同源性为100%,长1 447 bp,编码482个氨基酸,所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku,与预期的大小相符。结果表明,含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ抗原模拟表位的筛选与鉴定

将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ(APP ApxⅠ)抗血清用饱和硫酸铵分级粗提后,再经DEAE-sepha-dex-A50低压层析系统纯化得到IgG,用此IgG作为配基对噬菌体随机十二肽库进行4轮不同条件的富集筛选。通过改变筛选条件,噬菌体的回收率从1.44×10-6增加到了8.9×10-5,P/N值逐步提高,阳性噬菌体得到了富集。ELISA结果表明,随机挑取的10个噬菌体克隆中,有5个与纯化的IgG有较强的特异性结合能力。对筛选到的5个阳性克隆提取ssDNA进行测序,并对其递呈的氨基酸序列进行分析。结果有3个克隆的4个连续的氨基酸序列(RVDV)相同,并与APP ApxⅠ蛋白的原始序列具有较高的同源性。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素I基因的克隆、序列分析及表达

参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型Ⅰ菌株序列设计了一对特异性引物,用PCR方法扩增毒素Ⅰ基因,得到约920bp的片段,与参考序列的核苷酸同源性达99.3%,定向克隆到pET32a(+)中,转化BL21(DE3)