嗜水气单胞菌重组Aer毒素的纯化和抗原性分析

对原核表达的重组嗜水气单胞菌Aer毒素进行初步纯化,比较了它与天然Aer毒素的抗原性,为建立检测该毒素的免疫学方法奠定了基础。将原核表达的重组Aer毒素经SDS-PAGE后,切下目的蛋白,利用电洗脱法将蛋白洗脱出来,后经透析、PEG8000浓缩、定量,对獭兔进行免疫,采集血清,提纯IgG,在W estern b lotting试验中可与天然Aer毒素起反应,说明,体外表达的重组Aer毒素保留了天然Aer毒素所具有的抗原性。同时,将嗜水气单胞菌AHCS02菌接种于兔鲜血平板,30℃、培养15 h后,将具有β-溶血的单菌落于LB液体培养基中培养后,用饱和硫酸铵法提取上清液中的天然Aer毒素,用甲醛脱毒后,以同样免疫方法免疫獭兔,免疫结束后,采集血清提取IgG,在W estern b lotting试验中,可以检测到重组Aer毒素。试验说明:原核表达的重组Aer毒素和天然Aer毒素诱导獭兔产生的血清IgG抗体可以互相识别重组Aer毒素和天然Aer毒素,重组Aer毒素和天然Aer毒素有相似的抗原性。

嗜水气单胞菌Aer毒素和胞外蛋白酶卵黄抗体的制备

为克服嗜水气单胞菌不同血清型对卵黄抗体免疫保护效果的影响,从嗜水气单胞菌中提取其主要致病因子Aer毒素和胞外蛋白酶(ECPase),验证其生物学活性,分别免疫蛋鸡。用辛酸-硫酸铵法粗提卵黄抗体,用间接ELISA法测其效价、鉴定抗体与不同来源嗜水气单胞菌主要致病因子的交叉反应。结果表明,抗Aer毒素和抗ECPase卵黄抗体效价最高分别可达1∶213和1∶212,与其他来源嗜水气单胞菌交叉反应性强。

嗜水气单胞菌aer毒素基因的克隆及核苷酸序列分析

以自行分离的嗜水单胞菌分离株AHCS02为研究对象,分析其产生的aer毒素基因结构。根据G enB ank中aer毒素的基因序列(M 16495),设计扩增编码aer毒素成熟蛋白基因的引物,以AHCS02的基因组DNA为模板,PCR扩增出长度为1 332 bp的核苷酸片段,进行pM D 18-T载体克隆。酶切鉴定后进行序列测定和分析,结果表明扩增的片段与M 16495的同源性达92%,将测得的序列登录G enB ank数据库,所得的序列编号为AY 136943。分析推导其核苷酸编码的氨基酸序列显示:其编码443个氨基酸,为aer毒素成熟蛋白的基因,与M 16495相比,氨基酸差异主要集中在422氨基酸残基至436氨基酸残基的位置上,在这个位置上共有8个氨基酸残基发生变化,其中在435和437氨基酸残基之间有一个氨基酸密码子丢失,氨基酸的同源性达95.5%。证明aer毒素基因的5′端保守,3′端变异较大。