致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立

根据我国致病性嗜水气单胞菌分离株 AH-78-2气溶素 ( Aer)基因保守区的测序结果 ,设计 2对引物 ,建立了检测嗜水气单胞菌的 PCR方法。通过对 2 0株嗜水气单胞菌、1 2株相关菌株及 1 57份送检病料的检测 ,并与 SPA-Co A检测结果对照表明 ,PCR方法具有较高的敏感性与特异性 ,可检测最低 1 0 0 cfu的细菌。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的新途径 。

致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的水产动物样品进行多重PCR检测,结果与常规微生物学检测符合率为97.5%。多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,最低可检测模板量为10 ng的样品。该方法的建立对水产动物嗜水气单胞菌病的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。

鲢鳙鱼源致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定

从江西省南城县和广东省佛山市、韶关市患细菌性败血症病鲢鱼、鳙鱼体内分离到3株优势菌,人工感染鲢后证实为该病的病原菌,此3株菌对剑尾鱼的半致死量(LD50)分别为:2.64×105、9.24×104、4.45×105CFU/g。对3株病原菌进行形态特征、ATB细菌鉴定仪生理生化特性鉴定结果符合嗜水气单胞菌的特征;为进一步确定病原菌分类地位,对其16SrRNA序列扩增测序,并与相关细菌16SrRNA序列比对,构建系统发育树,在系统发育树中与嗜水气单胞菌聚类为一支。Aero气溶素基因PCR扩增出209bp条带,检测结果进一步表明此3株菌为含有毒力基因的致病性嗜水气单胞菌。

辽宁地区养殖淡水鱼感染嗜水气单胞菌的流行病学调查

通过RS选择性培养基和针对16S rDNA与气溶素基因的双重PCR检测技术,对采集于辽宁省不同地区、不同鱼类、不同症状病鱼感染的嗜水气单胞菌进行了系统的流行病学调查,并对致病性嗜水气单胞菌进行了毒力验证试验及对抗菌药物的敏感性试验。结果发现,51株临床样本中有26株分离菌扩增得到685 bp大小的目的片段,证明为嗜水气单胞菌,占分离细菌总数的50.98%,占绝对的优势,其中以出血症状为主的病鱼分离的菌占23.99%,以肠炎为主症状的病鱼分离菌占17.99%,以烂鳃症状为主病鱼分离菌占9%。26株嗜水气单胞菌中有17株同时扩增出252 bp大小的气溶素基因(aerA),表明这17株分离菌为致病性嗜水气单胞菌。人工感染试验结果表明,致病性嗜水气单胞菌均有毒力且毒力大小差异明显。药敏实验结果显示,嗜水气单胞菌不同分离株对抗生素的敏感性差异很大,对先锋V耐药率高达90%,对新生霉素、红霉素、利福平、四环素耐药率也相对较高,分别为56.2%,42.7%,37.5%,31.1%,而对氟哌酸、链霉素、庆大霉素则较敏感。该结果对建立片区病原库,揭示辽宁地区淡水养殖鱼类感染的嗜水气单胞菌的地理分布、毒力大小、耐药性差异,进而弄清嗜水气单胞菌的表型、基因型差异具有重要理论参考意义。

嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与序列分析

以嗜水气单胞菌BZ和NK分离株的DNA为模板，采用PCR技术，扩增气溶素基因（aerA）的DNA片段，将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定，分析结果表明-所克隆的1393bp片段为aerA部分序列，编码产生464个氨基酸。BZ与NK之间aerA核苷酸同源性为97．6％，氨基酸同源性为98．3％，与其它分离物核苷酸同源性为71．6％～97．5％，氨基酸同源性为68．0％～98．9％。利用邻接法构建了aerA分子树状图，树状图分析表明：气单胞菌属各分离物聚为三支，其中嗜水气单胞菌各菌株之间关系密切，被聚类为同一支。

嗜水气单胞菌双重PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank收录的细胞兴奋性肠毒素(alt)基因和气溶素结构基因(aerA),依据嗜水气单胞菌保守序列分别设计能检测alt和aerA基因的特异性引物,并进行PCR反应体系和反应条件的优化。建立了一种快速检测嗜水气单胞菌双重PCR方法。结果显示,在同一PCR反应体系中,供试菌株嗜水气单胞菌扩增2条目的带,扩增产物的片段大小分别为200bp和280bp,而对照菌株温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、河流弧菌的PCR扩增则无条带检出。敏感性试验结果显示,该双重PCR最低能检测3×104cfu/mL菌体密度的嗜水气单胞菌,对嗜水气单胞菌模板DNA的检出极限为49fg/μL;同时对送检的患病水产品进行抽检,检测出阳性结果的样品均可分离到优势生长的嗜水气单胞菌。结果证实,试验所建立的基于2种基因的双重PCR方法快捷、灵敏,为今后由于该菌所引起的水产动物疾病的检测提供了参考依据。

嗜水气单胞菌Lamp检测方法的建立及应用

基于嗜水气单胞菌气溶素（aerolysin）基因的序列，设计了1套引物，通过条件优化，成功建立了针对致病性嗜水气单胞菌的环媒恒温基因扩增（Lamp）检测法。采用Lamp法对病原菌进行了扩增，并对病鱼血样进行了检测。结果表明，该法只检出致病性嗜水气单胞菌。对不同浓度的细菌悬液扩增结果表明，Lamp检测嗜水气单胞菌的最低菌液浓度为1．4～14／μL。

嗜水气单胞菌实时荧光三重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对嗜水气单胞菌的高灵敏、高特异的实时荧光三重TaqMan聚合酶链式反应(PCR)快速检测体系。方法根据嗜水气单胞菌的16SrDNA、气溶素基因(aerA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahp)的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用高通量实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用29种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性。结果实时荧光三重TaqMan PCR快速检测体系对嗜水气单胞菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系;对嗜水气单胞菌基因组的检测灵敏度为5×10-2pg/反应体系;该体系的特异性引物探针在检测29种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现假阳性,整个反应在2h内完成。结论本研究建立的实时荧光三重TaqManPCR检测体系可作为嗜水气单胞菌灵敏、特异、快速的检测方法,并同时评价嗜水气单胞菌的致病潜力。

PCR扩增特异性16SrDNA和溶血素基因检测致病性嗜水气单胞菌

根据已发表的气单胞菌16SrDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列,设计了2对引物,建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测,发现16SrDNA引物具有高度的特异性,仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97.2%,且具有高度的敏感性,可检测最低1fg的模板。将16SrDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94.4%。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径,是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。

框镜鲤致病性维氏气单胞菌双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测框镜鲤致病性维氏气单胞菌(A.veronii)双重PCR方法,本研究以A.veronii CY0806株和国际标准株DNA为模板,分别以16S rRNA和Aer基因特异性引物进行PCR扩增,分别获得大小约880 bp和430 bp的DNA片段。通过序列比对分析,16S rRNA基因片段、Aer片段序列与GenBank中登录的A.veronii ATCC35624株的的同源性均为99%。进一步试验显示该方法的敏感性较高,达到1.58×10-3ng/μL,特异性较强,只有A.veronii标准株及分离株结果呈阳性;人工模拟污染样本试验显示:该方法的检出率达到了86.7%,高于细菌分离培养的70%检出率。双重PCR检测方法的建立,为框镜鲤致病性A.veronii的检测提供新的方法。

用PCR检测嗜水气单胞菌毒素基因

选取气单胞菌毒素基因中保守区的同源寡核苷酸序列为引物，用PCR技术检测临床分离的嗜水气单胞菌的毒素基因。扩增产物中均含有明显的预定条带；用AluI和AvaI酶切进一步鉴定，其酶切片段的数量和大小均与设计相吻合，证实样本中带有毒素基因。细菌在鲜血平板上呈现党大的β－溶血圈，用相应的单克隆抗体检测培养上清中的毒素，亦获阳性结果，进一步证实PCR技术检测气单胞菌毒素准确可靠。

MGB探针实时定量PCR检测致病性嗜水气单胞菌

以嗜水气单胞菌气溶素(aerolysin)基因为待检靶基因,设计一对引物和一条MGB(M inor Groove B inder)探针,Aero基因探针5′端用FAM基团标记,3′端用TaqMan-MGB标记。建立并优化了检测嗜水气单胞菌荧光定量PCR方法,可检测的最低细菌数为1.25×100CFU/μl;试验中嗜水气单胞菌检测结果均为阳性,而非嗜水气单胞菌检测结果均为阴性;重复性试验中,批间差异小于5%,批内差异小于3%。试验结果显示,荧光定量PCR方法可对致病性嗜水气单胞菌株进行快速鉴定。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径,是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立

[目的]建立一种基于PCR的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。[方法]采用平板划线法从患病鲫鱼病灶部位分离、纯化获得嗜水气单胞菌,采用CTAB法提取DNA,根据GenBank已经登录的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因保守序列设计引物P1和P2,并以P1、P2为引物对其进行PCR扩增,将测序结果在Blast上进行比对分析。[结果]PCR扩增得到一条约540 bp的条带,Blast分析表明该基因与GenBank登录的气溶素基因的同源性达95.67%。[结论]试验建立的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法简单、可行。

蟹源易损气单胞菌气溶素基因的克隆及其PCR检测

利用设计的特异引物,采用PCR技术,对蟹源致病性易损气单胞菌气溶素基因(aer)进了克隆和序列分析,从其基因组中克隆出长为622 bp的基因片断,用限制性内切酶BamHI对扩增产物进行酶切,产生长约570 bp和50 bp两条片断;研究还利用设计的特异引物,对蟹源致病性易损气单胞菌进行PCR快速分子鉴定的研究。

林蛙嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆及原核表达

以长白山林蛙中分离的嗜水气单胞菌为材料,对嗜水气单胞菌气溶素基因进行克隆、序列分析及基因表达等研究,为嗜水气单胞菌的分子生物学研究提供依据。通过实验成功克隆了气溶素基因,大小为1163bp,对其进行同源性检测,与基因库中DQ186611基因序列的同源性高达99%;构建原核表达重组质粒pGEX-Aer,在大肠杆菌BL21中获得表达,蛋白分子量约为69ku,以包涵体形式存在。

应用PCR快速诊断黄鳝嗜水气单胞菌败血症

根据致病性嗜水气单胞菌的标志性毒力基因-气溶素(aerolysin)基因序列,设计出一对特异性引物,采用PCR方法,对22尾临床疑似患嗜水气单胞菌败血症的黄鳝进行了诊断,检测出其中17尾呈致病性嗜水气单胞菌阳性,检测过程仅需6h;而常规细菌分离鉴定则耗时72h,检出率仅为9/22。

临床嗜水气单胞菌耐药性及 Aer 气胞溶素基因研究

目的：研究嗜水气单胞菌临床感染现状及其主要致病因子 Aer 气胞溶素基因的存在形式。方法收集深圳市人民医院龙华分院2012年～2013年间临床分离到的嗜水气单胞菌，VITEK 2 compact 对其进行鉴定与抗生素药物敏感性试验。数据录入 WHONET5.6软件进行临床分布与耐药率分析。提取染色体与质粒基因组，采用聚合酶链反应（PCR）法检测毒力基因 Aer 气胞溶素的存在形式。结果临床共分离到48株嗜水气单胞菌，分布于临床标本痰液16株、血液11株、分泌物10株、尿液7株与粪便4株。病区分布分散化，无集中趋势。耐药率显示对氨苄西林、氨苄西林／舒巴坦与头孢唑啉耐药率达80％以上，而对阿米卡星、头孢吡肟、左旋氧氟沙星、哌拉西林／他唑巴坦与亚胺培南处于10％以下的低水平。43.7％菌株携带 Aer 基因，位于染色体基因组。结论嗜水气单胞菌临床感染散发，多数染色体基因组携带毒力因子Aer 气胞溶素基因。对青霉素类，一代头孢类耐药严重，对广谱类药物保持敏感性。嗜水气单胞菌作为地区性重要条件致病菌，防范其耐药菌株扩散具有一定意义。

嗜水气单胞菌气溶素毒力基因检测研究

目的对嗜水气单胞菌气溶素基因进行检测并分析其携带率。方法采用常规法从三角帆蚌体内分离嗜水气单胞菌并鉴定,PCR法扩增气溶素毒力基因,计算其携带率。结果5株嗜水气单胞菌携带aer毒力基因,携带率为50%。结论气溶素基因是嗜水气单胞菌的重要毒力因子。