结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的 :构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 .方法 :采用 geneSOE ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3 行PCR扩增融合 ,经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3.1 (+)中构建真核表达质粒 pCDAg85B A ,酶切、DNA测序鉴定 ,用脂质体法将 pCDAg85B A转染COS 7细胞 ,采用RT PCR ,ELISA方法检测其表达 .结果 :Ag85B Ag85A融合基因定向克隆入pcDNA3.1 (+) ,双向测序表明碱基无突变 ,Ag85B Ag85A融合基因在真核细胞中能表达 .结论 :成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 。

Ag85A和Ag85B DNA疫苗对大鼠膀胱癌免疫治疗的效果

目的:探讨Ag85A和Ag85BDNA疫苗对大鼠膀胱癌免疫治疗的效果。方法:致癌剂N-甲基亚硝基脲(methyl nitrosourea,MNU)膀胱灌注雌性Wistar大鼠制备膀胱癌模型。将建模成功的48只大鼠随机分为生理盐水组、空白质粒组、卡介苗组、Ag85A DNA疫苗组、Ag85B DNA疫苗组、Ag85A+Ag85B DNA疫苗组(每组各8只),建模后第7、14、21天于大鼠右后肢肌内注射相应药物。第28天处死大鼠,流式细胞仪检测各组大鼠脾脏细胞的CD4+和CD8+T细胞亚群数量并计算CD4+/CD8+比值;ELISA法检测大鼠血清中IFN-γ分泌水平;剥离膀胱肿瘤进行组织病理学检查。结果:成功建立大鼠膀胱癌模型,致瘤率100%。经疫苗治疗后,Ag85A组、Ag85B组和Ag85A+Ag85B组膀胱肿瘤体积均有所减小、病理分级也有所减轻,但效果不及卡介苗组。Ag85A组、Ag85B组、Ag85A+Ag85B组和卡介苗组CD4+T细胞亚群数量分别为(17.27±2.95)%、(23.15±1.56)%、(30.80±1.83)%、(38.05±1.48)%;CD8+ T细胞亚群数量分别为(9.03±1.06)%、(10.28±0.39)、(11.29±0.74)、(13.14±1.24);CD4+/CD8+比值分别为(1.90±0.10)、(2.25±0.08)、(2.73±0.19)、(2.97±0.23);血清IFN-γ含量分别为(96.94±12.38)、(131.03±26.68)、(179.20±28.88)、(240.53±32.17)pg/ml;与生理盐水、空白质粒组相比,Ag85A组、Ag85B组、Ag85A+Ag85B组能够显著提高以上4项检测指标(P<0.01),但均低于卡介苗组;Ag85A+Ag85B组效果强于Ag85B组、更强于Ag85A组,差别有统计学意义(P<0.05)。结论:应用Ag85A和Ag85BDNA疫苗均可提高膀胱癌大鼠的免疫功能,其效果为Ag85A+Ag85B>Ag85B>Ag85A,但总体上都达不到卡介苗的抗癌免疫效果。

结核杆菌分泌蛋白Ag85A基因的克隆、表达及其诊断价值

目的获得重组抗原85A(rAg85A),研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法应用基因工程技术克隆、表达、纯化Ag85A蛋白,通过Western印迹分析其抗原性。分别以结核分支杆菌纯蛋白衍生物(PPD)或纯化的rAg85A蛋白为抗原,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果重组质粒pET30a-Ag85A测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的2％左右,Western印迹分析它与抗结核分支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化的rAg85A样品纯度约85％左右,每100 ml培养菌可获得2 mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值+2s为正常界限值,一步法的特异性和敏感性分别为87.9％和65.6％;PPD分别为93.9％和62.5％;rAg85A分别为93.9％和15.6％。结论pET30a-Ag85A大肠杆菌工程菌能以包涵体形式表达rAg85A蛋白,该蛋白具有较高的抗原特异性,但检测抗结核抗体的灵敏度低。

独立表达Ag85A与ESAT6的抗结核DNA疫苗的构建

目的以pIRES为载体建立可同时独立表达Ag85A与ESAT6两种抗原的抗结核二价疫苗,探究疫苗剂量对质粒基因体外表达水平的影响。方法 PCR扩增获得Ag85A基因和ESAT6基因,分别插入pIRES质粒的多克隆位点A和B,构建pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒。脂质体2000将重组质粒转入RAW264.7细胞系,Western blot法检测目的蛋白的表达水平。结果成功构建pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒,在转染后的RAW264.7细胞同时高表达Ag85A与ESAT6,其表达水平与转染的剂量呈正相关。结论 pIRES-Ag85A-ESAT6二价疫苗的构建将为基于多个抗原同时独立表达的新型多价疫苗设计提供了思路。

结核分枝杆菌Ag85A蛋白的原核表达、纯化和免疫反应性

目的通过原核表达获得结核分枝杆菌Ag85A蛋白。方法用PCR从结核分枝杆菌H37Rv菌株中扩增出编码Ag85A的fbpA基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,产生重组质粒pPro85A后,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21并诱导大量表达。用镍纯化系统纯化重组Ag85A蛋白,用不同分枝杆菌感染的小鼠血清通过ELISA确定其免疫反应性。利用PCR技术鉴定fbpA基因在不同分枝杆菌的分布。结果32 ku的Ag85A蛋白获得高效表达和纯化。表达Ag85A蛋白的fbpA基因在结核分枝杆菌H37Rv、H37Ra、BCG、草分枝杆菌、土地分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和次要分枝杆菌中均有表达,但在牝牛分枝杆菌中未表达。结核病患者和结核分枝杆菌毒株H37Rv感染小鼠血清所产生的抗Ag85A抗体滴度最高。结论重组Ag85A蛋白已成功表达纯化,并保留了免疫反应性。

细胞因子GM-CSF和结核杆菌Ag85A融合表达载体的构建与鉴定

目的 :构建并鉴定细胞因子GM CSF和结核杆菌Ag85A融合表达质粒 ,为研究新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。方法 :用PCR方法从pc mGM CSF质粒中扩增出GM CSF ,构建于pcDNA3 1质粒上 ,成为pcDNA3 1 GM CSF。从结核杆菌H3 7Rv基因组中扩增出结核杆菌Ag85A基因序列并插入到质粒pcDNA3 1 GM CSF上 ,将基因GM CSF的 3′端与基因Ag85A的 5′端直接连接构建融合表达质粒pcGM85A。结果 :经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确。结论 :细胞因子GM CSF和结核杆菌Ag85A融合表达载体构建成功 ,为研制新型结核病基因疫苗奠定了基础。

结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗的构建和免疫原性研究

目的 构建编码结核分枝杆菌蛋白Ag85A基因为基础的DNA疫苗。 方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因组中 ,扩增出分泌蛋白Ag85A成熟蛋白的编码基因 ,用限制性内切酶消化后 ,插入克隆载体 pGEM TEasy中。经酶切鉴定与序列测定证实后 ,以亚克隆法构建于真核表达载体 pcDNA3.1的相应酶切位点。重组质粒肌注免疫小鼠 ,4周后用ELISA法检测抗体滴度。结果 结核分枝杆菌H37Rv株Ag85A成熟蛋白的编码基因经序列测定证实无突变 ;经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定证实克隆基因正确插入载体 pcDNA3.1。ELISA法检测几何平均滴度为 1∶10 0 0。结论 以Ag85A成熟蛋白的编码基因为基础的DNA疫苗的成功构建和表达 。

结核杆菌Ag85A/GM-CSF嵌合表达质粒的构建及表达

目的 探索对结核病DNA疫苗进行基因修饰的新方法。方法 以结核杆菌H3 7Rv 株基因组DNA为模板 ,通过PCR扩增获得结核杆菌Ag85A抗原蛋白基因的成熟肽编码区 ,以经PHA诱导后的小鼠脾组织总RNA为模板 ,通过RT PCR获得小鼠粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子的cDNA ,将二者定向克隆入质粒pBK CMV中构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转染培养的COS7细胞后检测嵌合目的基因的表达。结果 成功构建了小鼠粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子cDNA与结核杆菌Ag85A抗原基因的真核嵌合表达质粒 ,重组质粒能在COS7细胞中进行稳定表达。结论 本研究首次将细胞因子基因与结核杆菌免疫保护性抗原基因嵌合构建嵌合DNA疫苗 。

KLIANNTRV是结核抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL表位

目的鉴定结核杆菌抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL优势表位。方法采用数据库SYFPEITHI初步预测结核抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL表位;经流式细胞术分析抗原肽与HLA-A*0201的亲和力;经时间荧光分辨法检测患者外周血单个核细胞(PBMCs)对抗原肽的增殖反应;最后通过细胞毒实验逐步鉴定Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL预测的表位。结果实验证明,预测的位于Ag85A氨基酸序列(242-250aa)的肽表位与HLA-A*0201具有较高的亲和力。结论筛选出的KLIANNTRV(242-250aa)是结核杆菌抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL优势表位。

人细胞因子IL-12p70与结核分枝杆菌特异性抗原Ag85A融合基因重组卡介苗的构建及鉴定

目的:构建可表达融合蛋白IL-12p70-Ag85A的重组卡介苗,为结核病新疫苗的研制奠定基础。方法:以穿梭表达质粒pMV361为载体,构建重组质粒rpMV361-IL-12p70-Ag85A。将成功构建的重组质粒以电转化方式导入BCG基因组构建重组卡介苗rBCG-IL-12p70-Ag85A。通过抗生素筛选、重组卡介苗基因组PCR扩增及测序,以及western-blotting对重组卡介苗进行鉴定。结果:经鉴定,重组卡介苗成功构建,并可表达融合蛋白IL-12p70-Ag85A。结论:重组卡介苗rBCG-12p70-Ag85A构建成功,并可高效表达目的蛋白。

传统 BCG 初免 IL-12联合 Ag85A DNA 疫苗加强序贯免疫小鼠效果观察

目的探讨BCG初次免疫,IL-12联合结核分枝杆菌Ag85ADNA疫苗加强免疫对小鼠的免疫效果。方法实验小鼠随机分为7组,即PBS阴性对照组、BCG组、pcAg85A组、BCG初免pcAg85A加强免疫组、BCG初免pcAg85A联合IL-12加强免疫组、BCG初免IL-12加强免疫组、以及BCG初免pcDNA3.1加强免疫组。按BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85ADNA加强的免疫程序进行免疫实验,在末次免疫后的4、6、8周通过检测小鼠血清总IgG抗体、特异性淋巴细胞增殖,细胞因子的水平,观测对小鼠的免疫效果。结果采用BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加强的免疫策略组的小鼠与其它免疫方式组相比,IgG明显升高(P<0.05)、特异性淋巴细胞明显增殖,加强免疫后IFN-γ水平、IL-2水平、IL-4水平BCG/Ag85A+IL-12组在3个时间段分别为128.2±20.4、190.2±16.51、244.2±39.14;146.2±17.29、271.6±16.36、419.3±28.12;68.6±6.62、96.6±5.5、117.4±10.71均高于其它各组(P<0.05)。结论采用BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85ADNA疫苗加强的免疫能明显增强机体体液和细胞免疫,为进一步在动物体内进行保护性效应试验的研究提供了依据。

可表达结核分枝杆菌融合蛋白Ag85A-ESAT-6重组卡介苗免疫保护作用研究

目的以Balb/c小鼠为动物模型,评价重组卡介苗新型结核病疫苗rBCG-Ag85A-ESAT-6(rBC-AE)的免疫保护效应。方法将重组卡介苗rBCG-AE免疫动物10周后,结核分枝杆菌H37Rv尾静脉注射进行感染攻击,分别于感染攻击后3、6和9周,通过观察肺组织大体病变、脾肺组织细菌载荷量计数、肺组织抗酸染色、HE染色结合肺组织病理变化,综合评价该疫苗诱导的免疫保护作用。结果 rBCG-AE组脾肺组织细菌载荷量在各时间点均显著低于阴性对照组(PBST组,P<0.01),但明显高于卡介苗(BCG)组(P<0.01)。rBCG-AE组肺组织病变在感染攻击后6～9周逐渐改善,但其病理打分在各时间点均明显高于BCG组(P<0.01)。各组肺组织大体病变与组织病理打分变化相似。结论重组卡介苗rBCG-AE仅能诱导产生与BCG疫苗相当甚至较低的免疫保护作用。

结核分枝杆菌重组Ag85A、Ag85B蛋白免疫原性的研究

目的研究结核分枝杆菌重组Ag85A(rAg85A)和/或Ag85B(rAg85B)蛋白与母牛分枝杆菌菌苗(Mycobacteri-um vaccae,MV)联合免疫的免疫原性。方法 60只雌性BALB/c小鼠随机分为下列6组:(1)阴性对照组:磷酸盐缓冲液(PBS)组,(2)阳性对照组:卡介苗(BCG)组,(3)阳性对照组:MV组,(4)实验组:rAg85A-MV组,(5)实验组:rAg85B-MV组及(6)实验组:rAg85A-rAg85B-MV组。每2周免疫1次,共免疫3次。末次免疫结束后第14天杀鼠,用ELISA法检测血清中IgGI、gG1和IgG2a水平;ELISPOT检测脾脏分泌γ干扰素(IFN-γ)的T淋巴细胞斑点数;流式细胞术检测全血单个核细胞内Th1和Th2百分比。结果三个实验组小鼠血清抗体水平均明显高于三个对照组(P<0.001);三个实验组和两个阳性对照组小鼠的T淋巴细胞斑点数均明显高于阴性对照组(P<0.05);rAg85A-rAg85B-MV组小鼠Th1百分比明显高于其余五组(P<0.001),三个实验组Th1/Th2比值均明显高于三个对照组(P<0.05)。结论结核分枝杆菌rAg85A和rAg85B蛋白均具有很强的免疫原性,与MV联合免疫可增强其Th1型细胞免疫应答。

结核杆菌Ag85A及ESAT-6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的 为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法 采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和Western -blotting对表达蛋白进行初步分析。结果 1)从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ag85A及ESAT - 6基因。 2 )成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达质粒 pBK - 85A -E6。 3)重组质粒 pBK - 85A -E6经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 38kDa的融合蛋白。 结论 成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达载体 ,并在大肠杆菌中实现了稳定表达 ,为进一步研究其在结核病基因工程疫苗研制中的应用奠定了基础。

结核分枝杆菌重组Ag85A蛋白抗原诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究

目的 :结核分枝杆菌重组Ag85A抗原诱发豚鼠迟发型超敏 (DTH)反应。Ag85A剂量、观察时间对DTH的影响。方法 :常规皮肤实验法 :灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠 ,皮肤试验以生理盐水为阴性对照 ,5IUPPD标准品为阳性对照 ,0 .1、0 .2、0 .4、0 .6、0 .8及 1.0 μg重组抗原分别于背部皮内注射 ,注射后 2 4、4 8及 72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。皮肤试验轮圈法 :生理盐水、5IUPPD及 0 .4、0 .6、0 .8、1.0 μgAg85A抗原 ,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部一侧 ,每批 6只 ,共 3批。于注射后 2 4、4 8、72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。结果 :常规皮肤试验 0 .1、0 .2 μg重组Ag85A抗原诱发DTH的平均直径与PPD相比有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,而 0 .4、0 .6、0 .8、1.0重组Ag85A抗原诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比 ,无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,2 4h平均直径显著高于 4 8h平均直径 (P <0 .0 5 ) ,2 4h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后结果与常规皮肤试验结果一致。结论

结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A的基因克隆与表达研究

目的 为结核病新型疫苗研制提供靶基因和靶抗原。方法 根据结核杆菌 H 37Rv株免疫保护性抗原 Ag85 A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物 ,以结核杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增获得具有完整开架读码框 (ORF)的 Ag85 A抗原基因 ,并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体 p BK- CMV构建重组质粒 ,重组质粒转入大肠杆菌后 IPTG诱导表达 ,并对其表达产物进行 Western- blotting分析。结果 PCR扩增获得了具有完整开架读码框的 Ag85 A抗原基因 ;构建了 Ag85 A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体 ;Ag85 A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达。结论 成功地对结核杆菌免疫保护性抗原 Ag85 A进行了基因克隆与表达 。

结核分枝杆菌Ag85A DNA的克隆与原核表达

抗原85(Ag85)复合体是BCG合成分泌的可刺激机体产生细胞免疫和体液免疫应答。Ag85A是抗原85复合体组成成分之一,可显著刺激细胞免疫功能增强。研究构建了高效表达的pTrcHisB-Ag85A基因重组质粒,并将其转化至大肠埃希菌TOP10中进行重组蛋白的表达,筛选转化物,SDS-PAGE进行蛋白表达的分子量检测,并通过Western Blotting方法,应用抗Ag85A的单克隆抗体进一步确认重组Ag85A蛋白的表达,建立了Ag85A的原核表达体系,为进一步制备出有效的重组Ag85A疫苗奠定基础。

Ag85a-卡介苗重组疫苗对结核病预防及治疗作用的研究

目的评价Ag85a-卡介苗重组疫苗对结核病预防及治疗效果,期望得到对结核病的预防效果强于卡介苗的重组疫苗。方法观察Ag85a-卡介苗重组疫苗对结核分支杆菌感染的预防试验和治疗实验中实验动物半数死亡时间、一定时间内的死亡率、大体病变、T细胞及B细胞免疫功能等指标评价各卡介苗重组疫苗的抗结核作用。结果用Ag85a-卡介苗重组疫苗对结核分支杆菌感染进行预防,Ag85a-卡介苗重组疫苗及卡介苗与生理盐水对照组比都能延长结核分枝杆菌感染小鼠的半数死亡时间,降低2个月内的死亡率。结核分枝杆菌攻击后2个月,处死小鼠时,Ag85a-卡介苗重组疫苗免疫组小鼠脏器与其他各组之间无显著差别。各组小鼠脏器研磨、消化后稀释为不同梯度进行培养Ag85a-卡介苗重组疫苗免疫小鼠肺脏结核分支杆菌生长的最低稀释度主要集中在10-5,肝、脾结核分枝杆菌生长的最低稀释度主要集中在10-4。抗体检测结果及淋巴细胞增殖实验各组间无显著差别。卡介苗重组疫苗对结核病的治疗试验结果中半数死亡时间与2个月内的死亡率反而不如预防的效果,说明卡介苗或卡介苗重组疫苗等活体疫苗作为结核病治疗性疫苗无明显的治疗效果。结论初步实验表明:Ag85a-卡介苗重组疫苗对结核分支杆菌感染的预防作用与卡介苗无显著区别,卡介苗或Ag85a-卡介苗重组疫苗等活体疫苗作为结核病治疗性疫苗无明显的治疗效果。

Ag85A与Ag85B DNA疫苗联合免疫对可移植性鼠膀胱肿瘤的免疫调节效应

目的探讨联合应用Ag85A与Ag85B DNA疫苗抗膀胱肿瘤的免疫效应。方法采用小鼠膀胱癌BTT739细胞株,构建可移植性T739小鼠膀胱肿瘤模型。随机法分为6组:生理盐水组、BCG组、pcDNA3.1+组、pcDNA-Ag85A组、pcDNA-Ag85B组及pcDNA-Ag85A和pcDNA-Ag85B联合组。荷瘤后第7天、14天和21天各肌注1次,末次注射后第7天检测各组小鼠脾脏的CD4+和CD8+T细胞亚群数量及CD4+/CD8+比值、小鼠血清IFN-γ、肿瘤体积重量并进行组织病理学检查。结果Ag85A与Ag85B DNA疫苗联合免疫组CD4+和CD8+T细胞亚群数量及CD4+/CD8+比值、血清IFN-γ明显高于DNA疫苗单独免疫组;小鼠的肿瘤重量明显低于DNA疫苗单独免疫组,差异有显著性(P<0.05);肿瘤组织病理学分析Ag85A与Ag85B DNA疫苗联合免疫组肿瘤坏死较DNA疫苗单独免疫组明显,且瘤体周围及瘤体内炎性细胞浸润较多。但Ag85A与Ag85B DNA疫苗联合、pcDNA-Ag85A、pcDNA-Ag85B DNA疫苗单独应用组均不及单纯应用BCG的免疫调节效应。结论Ag85A与Ag85B DNA疫苗联合免疫在抗膀胱肿瘤过程中具有明显的免疫效应,明显优于DNA疫苗单独免疫,二者联用具有协同增强免疫效应;但Ag85A与Ag85B DNA疫苗联合免疫效应尚达不到BCG的作用。

结核分枝杆菌Ag85A/MPT-64融合基因DNA疫苗的构建及免疫研究中ELISPOT技术的应用

目的构建结核分枝杆菌蛋白Ag85A/MPT-64融合基因为基础的DNA疫苗,并利用ELISPOT技术检测其免疫原性。方法利用PCR和基因克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85A/MPT-64编码基因,构建真核表达载体,用酶切和双向DNA测序进行鉴定。鉴定正确的阳性克隆重组质粒,肌注免疫小鼠,3周后用ELISPOT法检测抗体滴度。结果 构建到真核载体中的结核分枝杆菌H37Rv株Ag85A/MPT-64融合基因经序列测定证实无突变。ELISPOT法检测几何平均滴度为1∶1 000。结论以Ag85A/MPT-64融合基因为基础的DNA疫苗的成功构建和表达以及ELISPOT技术的应用,为进一步研究其在结核病与肿瘤防治方面的作用奠定了基础。