细粒棘球绦虫AgB8/1-AgB8/2重组嵌合抗原表达系统的构建

目的构建pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核细胞表达。方法从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板,用基因特异性引物分别扩增EgAgB8/1和EgAgB8/2基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此两条基因片段为依据,人工合成EgAgB8/1-EgAgB8/2嵌合抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm-T载体,测序鉴定其正确性。通过对pUCm-T/AgB8/1-AgB8/2重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8/1-AgB8/2嵌合抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段正确后,转化至E.coliBL21(DE3)Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgB8/1-AgB8/2重组嵌合蛋白。用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平。结果测序表明,AgB8/1-AgB8/2嵌合抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒。SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组嵌合蛋白得到成功表达,在相对分子量约38 kD处有表达条带。结论成功构建了pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达质粒,并初步诱导表达出AgB8/1-AgB8/2嵌合重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。

细粒棘球蚴重组抗原B 8-kDa亚单位1对囊型包虫病的血清学诊断价值

目的通过基因工程技术获得细粒棘球蚴抗原B8-kDa亚单位1重组蛋白(rEgAgB8/1),探讨其对囊型包虫病(CE)的血清学诊断价值。方法将构建的rEgAgB8/1原核表达质粒(pET32b-rEgAgB8/1)转化至E.coli BL-21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经亲和层析纯化获得高纯度rEgAgB8/1,以rEgAgB8/1为抗原,应用ELISA和Immuno blotting方法对31例手术确诊的囊型包虫病病人血清进行了回顾性检测与分析。结果ELISA和Immuno blotting方法检测CE病人血清阳性率均为90.3%(28/31),3例血清学检测阴性的CE病人均为初次诊断为CE及单纯性肝脏单发感染的病人;血清抗体水平随着病人棘球蚴囊数目增加而有所增加,棘球蚴囊的数目与血清抗体水平的比较用单因素方差分析有显著性差异(F=5.06,P=0.0142),1个囊与2个囊/3个囊组间血清抗体水平有显著差异,2个囊与3个囊组间差异无统计学意义。结论rEgAgB8/1重组蛋白抗原对囊型包虫病有较高的血清学诊断价值,多囊型包虫病人血清抗体水平高于单囊型包虫病人。