石油生物脱硫菌Agrobacterium tumefaciens UP-3

对能降解二苯并噻吩(DBT)的根癌土壤杆菌AgrobacteriumtumefaciensUP3菌株进行了固定化研究,以聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠(SA)混合物为包埋法固定化载体,固定化最佳操作条件为4℃交联,PVA和SA混合物总浓度7%,两者最佳浓度比为6,细胞浓度为0.05g/mL。当DBT加入量为2.7mmol/L时,UP-3的静息细胞最高脱硫率为13%,而固定化细胞的脱硫效率超过了60%;固定化细胞的最佳使用条件为降解5d,温度28℃～32℃。

AgNO_3对根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化的影响

以甘薯优良栽培品种“南薯 88”为试材 ,研究了AgNO3 对根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化的影响 .结果表明 ,在预培养的培养基附加AgNO3 不利于进行转化 ,而在共培养培养基中附加AgNO3 则对转化有促进作用 .当培养基中AgNO3 的浓度为 6mg/L时 ,卡那霉素抗性芽的获得率达最大值 ,为 2 7 5 % .文中还对AgNO3 在甘薯遗传转化中的作用方式及在建立较简便。

根癌农杆菌介导法获得烟草转人骨形成蛋白-3成熟肽基因植株

利用冻融法将质粒 p CAMBIA- h BMP- 3 m直接转入根癌农杆菌 LBA440 4 ,以烟草无菌苗叶盘为外植体 ,通过农杆菌介导法进行遗传转化 ,获得了在含 2 5 mg/L潮霉素 (Hy-gromycin,Hyg)的筛选培养基上再生的抗性植株 ,经 PCR检测呈阳性 ,初步鉴定并筛选整合了人骨形成蛋白 -

根癌农杆菌介导的人骨形成蛋白-3成熟肽基因向油菜转化的研究

用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)共培养法,将骨形成蛋白-3成熟肽(hBMP-3m)基因导入甘蓝型自交系油菜(BrassicanapusL.)品种秦油-3号,并获得了hBMP-3m基因整合到油菜基因组中的植株。试验所用外植体为油菜4～5d苗龄的下胚轴;根癌农杆菌为LBA4404,其Ti质粒pCAMBIA-hBMP3m含hBMP-3m基因。切取2mm左右的下胚轴侵染根癌农杆菌后在分化培养基(MS+5.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA)上共培养2d,然后转到附加25mg/L潮霉素和500mg/L羧苄青霉素的分化培养基上。切下分化出的茎芽,插入附加25mg/L潮霉素的生根培养基(MS+0.4mg/LIBA)中,形成完整的植株。经PCR检测和Southernblot分析,证实hBMP-3m基因已插入到油菜细胞基因组中。

拟南芥ATLP-3基因在转基因烟草中的整合和表达

将拟南芥 ATL P- 3基因从质粒 p UCTL 亚克隆到植物表达载体 p BI12 1中 ,得到的质粒命名为p BITL。被亚克隆到重组质粒 p BITL 的 ATL P- 3基因通过农杆菌 L BA44 0 4介导法导入烟草 (N icotiana tobacco L.var Gexin No.1)。通过卡那霉素抗性筛选 ,得到 19株再生烟草植株。PCR(用根据 ATL P- 3基因合成的引物 )检测到其中 4株 (A1、A4、B2、C6 )有 ATL P- 3基因的整合。进一步的 PCR(用根据 Ca MV35 s启动子和 NOS终止子序列合成的引物 )分析表明 ,ATL P- 3基因是在 Ca MV35 s启动子和 NOS终止子控制下整合到烟草的基因组 DNA中的。 4株转基因烟草的 Southern blotting检测结果显示 ,只有被整合到 B2和 C6的 ATL P- 3基因稳定地存在于基因组 DNA中 ;Western blotting检测分析表明 ,仅有 C6转基因植株表达了 ATL P-

鸡β-防御素Gal-3在转基因紫花苜蓿中的表达

【目的】在紫花苜蓿中表达鸡β-防御素3(Gal-3),为利用紫花苜蓿规模化生产Gal-3奠定基础。【方法】PCR扩增鸡Gal-3基因,以潮霉素作为转基因植物的选择标记,将鸡β-防御素Gal-3基因克隆至表达载体pCAM-BIA1390R(简写为p1390R)上,构建重组表达质粒p1390R-Gal-3;采用冻融法将质粒p1390R-Gal-3转入根瘤农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化至紫花苜蓿;采用PCR检测、Southern blot筛选阳性转基因苜蓿植株,并对Gal-3蛋白进行抑菌活性研究。【结果】PCR扩增获得了240bp的鸡Gal-3基因,成功构建植物表达载体p1390R-Gal-3,在苜蓿中初步建立了Gal-3的遗传转化体系,共获得22株转基因苜蓿植株,其中4株为阳性植株,转化率为18.2%。PCR扩增和Southern blot检测表明,Gal-3基因已整合到转基因苜蓿基因组中。提取转基因苜蓿的Gal-3蛋白进行抑菌活性试验,结果显示转基因苜蓿对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均有抑制作用。【结论】获得了具有抑菌活性的转鸡β-防御素Gal-3基因的苜蓿植株。

hBMP-3m基因在烟草中的表达

PCR扩增人骨形成蛋白-3成熟肽 hBMP-3m cDNA,纯化后连接入pUC19质粒,构建克隆载体pUC19B3m;用EcoR 和Hind 酶解pUC19B3m和pJIT163,将目的片段插入pJIT163,构建中间载体pJIT163-B3m;再构建植物表达载体pCAMBIA1300-B3m.利用冻融法将质粒pCAMBIA-hBMP3m转入根癌农杆菌 A-grobacteriumtumefaciens LBA4404.以烟草 NicotianatabacumL. 无菌苗叶盘为外植体,通过根癌农杆菌介导法进行遗传转化,获得了在含25mg/L潮霉素 Hygromycin,Hyg 的筛选培养基上再生的抗性植株,经PCR证实其中部分植株已将人骨形成蛋白-3成熟肽基因整合到烟草基因组中,WesternBlot结果表明已有微量BMP表达.

根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、结构预测及原核表达

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶能够催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。为实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的异源表达,设计引物,克隆并分离其序列,通过生物信息学软件分析D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DNA和蛋白质的结构特点。结果表明,该基因开放阅读框870bp,编码289个氨基酸;蛋白质二级结构中α-螺旋占38.41%,β-折叠占47.06%,无规则卷曲占14.53%;该蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,定位于细胞膜;构建原核表达载体并导入E.coliBL21宿主中,表达的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶分子质量约为33kDa,1mmol/LIPTG诱导E.coliBL21重组菌28h后,目的蛋白表达量和酶活分别为0.32g/L和3.8U/mL。根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因能够在大肠杆菌中实现表达。

脯氨酸、硝酸银对农杆菌转化大豆的影响

农杆菌介导的遗传转化技术是植物遗传转化中广泛采用的一种技术。如何提高转化率是植物遗传转化中的一个关键问题。已发现有许多物质能够促进农杆菌介导的遗传转化 ,如乙酰丁香酮 (AS)等许多酚类化合物都有助于农杆菌T -DNA的转移从而提高转化率。本实验在农杆菌转化大豆的过程中辅加化合物脯氨酸、硝酸银 ,通过对GUS基因表达的分析 ,结果表明这两种化合物均能明显地提高大豆的转化率 ,其中 2mg L浓度的脯氨酸及 2mg L的AgNO3 具有最佳效果 。

二苯并噻吩生物降解菌培养和反应条件的优化

考察了培养温度、时间、pH值对根癌土壤杆菌UP-3生长的影响,选择了最合适的培养条件。通过考察底物浓度、反应温度和反应时间对菌株UP-3降解二苯并噻吩(DBT)性能的影响,优化了生物降解的反应条件。结果表明:UP-3最佳培养条件为培养温度31℃,培养时间30 h,培养基pH值7.3;UP-3催化降解DBT反应的适宜条件为DBT质量浓度500 mg/L,反应温度31℃,反应时间35 h;适宜条件下UP-3生长细胞对DBT的降解率达到85%,说明其具有较好的应用潜力。

农杆菌介导的玉米弯孢叶斑病菌遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化法对玉米强致病性弯孢菌CX-3进行转化,得到具潮霉素B抗性且能稳定遗传的转化子30个。随机选取11个突变子进行PCR鉴定,结果表明外源T-DNA片段已经整合到CX-3的基因组中。通过形态学观察发现6个转化子在颜色、生长速度及产孢量方面有明显变化。

利用传质助剂提高柴油生物脱硫效率

为了提高柴油的生物脱硫效率必须提高油品中硫化物在水中的溶解度。采用生物脱硫菌根癌土壤杆菌UP-3,以非离子表面活性剂Tween80、Span80、OP-10和发酵添加剂作为传质助剂,考察了传质助剂的加入对模拟柴油和加氢柴油中脱硫菌的生长细胞、静息细胞脱硫性能的影响,同时考察了传质助剂加入对脱硫菌生长的影响。结果表明,在模拟油体系和加氢脱硫柴油体系中,柴油生物脱硫菌UP-3的脱硫效果随着油/水体积比的降低而增加;表面活性剂的加入可以促进其生长、显著提高UP-3生长细胞的生物脱硫性能;在一定程度上提高了静息细胞的脱硫活性。在油/水体积比为3/10时,可将UP-3对模拟柴油的最大脱硫率提高50%左右,将UP-3对加氢脱硫后柴油的最大脱硫率提高40%左右。

β–1,3葡聚糖酶基因转化提高苹果对斑点落叶病的抗性

为提高苹果抗病性,利用根癌农杆菌介导的叶片转化法,将带有NPTⅡ筛选基因、GUS标记基因及β–1,3葡聚糖酶目的基因质粒导入‘富士’和‘嘎拉’苹果。具有卡那霉素(Kan)抗性的转化株系,经GUS组织化学染色及PCR扩增检测,得到17个‘嘎拉’阳性株系和11个‘富士’阳性株系。选取‘嘎拉’和‘富士’各3个阳性株系进行Southern blot检测,结果表明外源目的基因已整合到所试转化株系中。选取‘嘎拉’及‘富士’各5个阳性株系进行半定量RT-PCR检测,除1个‘富士’株系没有条带外,其余株系均有阳性条带,且各条带的明亮清晰程度有差别,说明不同转基因株系中目的基因的表达量有差异。转化植株离体叶片接种苹果斑点落叶病菌进行抗病性表型检测结果证实,‘嘎拉’10个转化株系中8个株系表现抗病,7个‘富士’转化株系中2个株系表现一定的抗病性,抗病性的增强与目的基因的表达水平有关。

新一代高产甘油重组菌的构建及其初步发酵

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes WL2002-5)是一株发酵生产甘油的工业化菌株。为进一步提高其产甘油能力,本研究利用前期研究中成功克隆的产甘油假丝酵母中甘油合成关键酶3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD1,构建根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1后,电击转化根癌农杆菌LBA4404,通过根癌农杆菌介导法(ATMT)转化产甘油假丝酵母,构建了产甘油假丝酵母重组菌。并从中筛选出一株酶活力和产甘油性能较好的产甘油假丝酵母重组菌株C.g-G8。以葡萄糖为底物摇瓶发酵96h后,重组菌C.g-G8的甘油产量比野生型菌株Candida glycerinogene提高18.06%,平均耗糖速率提高12.97%,平均酶活力提高27.55%。本研究成功利用ATMT法转化产甘油假丝酵母构建新一代高产甘油菌株。