花生AhGPAT9基因启动子克隆及其功能分析

为研究花生油脂合成功能基因AhGPAT9的调控机理,分析其启动子功能,从花生品种Tifrunner基因组中扩增获得AhGPAT9基因启动子序列,构建AhGPAT9全长启动子及其多个5’缺失启动子融合GUS基因的重组表达载体,利用农杆菌介导的植物转化体系,分析启动子的活性和表达模式,结果表明:AhGPAT9启动子序列全长1750 bp,核心区位于-257 bp~-128 bp,该启动子除了具备核心元件CAAT-box和TATA-box,还包含多种响应激素调控、胁迫诱导、光反应、胚乳特异表达和生长调控相关的顺式作用元件。此外,AhGPAT9主要在转基因拟南芥的幼苗中,以及抽薹期的茎和茎生叶、小花、9-12DAP角果和对应的成熟胚中表达。本研究结果将为进一步阐释AhGPAT9在花生油脂合成途径中的生物学功能提供新的理论依据。

花生AhGPAT9与AhLPAAT4基因的原核表达及Western Blot分析

酰基转移酶基因家族是甘油三酯合成的关键基因。本研究以前期克隆的AhGPAT9与AhLPAAT4基因部分序列设计引物,构建原核表达载体,转化进大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE检测表明,重组蛋白在37℃,5h诱导条件下获得高效表达。重组蛋白经纯化和富集,对新西兰兔进行4次免疫,纯化获得的多克隆抗血清,通过间接ELISA检测,表明获得了效价比较高的多克隆抗体。通过对重组蛋白纯化后样品进行Western Blot分析,结果显示在纯化样品相应位置有明显信号,表明所制备的抗体具有很高灵敏度和特异性。并采用制备的抗体对AhGPAT9与AhLPAAT4蛋白在花生不同组织及种子不同发育时期的表达进行了Western Blot分析。为深入研究AhGPAT9与AhLPAAT4基因的功能提供了科学数据。