木通皂苷D促进糖皮质激素环境下小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化

目的观察木通皂苷D(ASD)对糖皮质激素(GC)环境下小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响及其机制。方法体外培养小鼠BMSCs,实验分为三组,分别用成骨诱导培养基(OBI)、OBI+地塞米松(DEXA,0.1μmol/L)、OBI+DEXA(0.1μmol/L)+ASD(10μmol/L)干预。ALP试剂盒检测ALP活性,茜素红染色检测矿化情况,qRT-PCR检测成骨因子Runx2、骨钙素(OCN)及Smad1、Smad5 mRNA表达,Western blot检测Smad1/5磷酸化水平及Smad1/5/8总蛋白表达。结果OBI+DEXA组ALP活性明显较OBI组低(P<0.001),OBI+DEXA+ASD组ALP活性明显较OBI+DEXA升高(P<0.01)。OBI+DEXA干预组成骨相关因子Runx2、OCN、Smad1和Smad5 mRNA表达较OBI组均明显下调(P<0.01),OBI+DEXA+ASD组Runx2、OCN、Smad1和Smad5 mRNA表达较OBI+DEXA干预组明显上调(P<0.01和P<0.05)。三组Smad1/5/8总蛋白表达差异无统计学意义,OBI+DEXA干预组pSmad1/5较OBI干预组表达降低,OBI+DEXA+ASD干预组pSmad1/5表达较OBI+DEXA干预组增加。结论ASD可促进GC环境下小鼠BMSCs成骨分化,其机制可能与激活BMP/Smad信号通路有关。

木通皂苷D通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞

目的:探讨木通皂苷D(ASD)是否促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为成骨细胞及其机制。方法:分离培养大鼠BMSCs;观察ASD对其向成骨细胞分化的影响以及p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂SB203580和细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂PD098059的干预作用;检测BMSCs分化过程中碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OC)含量;实时荧光定量PCR检测护骨素(OPG)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)mRNA的表达;Western blotting法检测p38 MAPK和ERK活性水平。结果:ASD处理后第9 d,成骨性分化标志物OPG mRNA表达量明显增高,RANKL mRNA的表达量明显降低,同时显著提高BMSCs分化为成骨细胞的ALP活性和OC的表达,而且p38 MAPK和ERK活性也显著增加。SB203580和PD098059则显著抑制ASD的成骨作用。结论:ASD在体外具有促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化的作用,这一作用与MAPK途径的p38 MAPK和ERK蛋白有关。

液相色谱-质谱联用法测定大鼠血浆中木通皂苷D的浓度

目的建立液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)测定大鼠血浆中木通皂苷D的浓度。方法选用XDB-C18色谱柱,以5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)-甲醇溶液为流动相,采用梯度洗脱进行分离。样本经甲醇沉淀后进样,选用3200QTRAP型质谱仪的多重反应监测扫描方式进行检测。结果木通皂苷D线性范围为10～1000 ng/ml,最低定量限为10ng/ml。准确度与精密度结果显示方法日间、日内变异均小于15%,相对误差为-2.8%～4.6%,低、中、高3个浓度提取回收率为95.3%～108.1%。结论本研究所建立的方法快速、灵敏、专属性强、重现性好,可用于大鼠血浆中木通皂苷D浓度的测定和药代动力学研究。

不同产地续断木通皂甙D含量比较

本文以HPLC法测定药材中Akebia saponon D的含量为指标,分析不同产地继断的质量,结果显示四川的木里及盐源、湖北的五峰及长阳地区产的继断质量优良,其中以四川省盐源地区质量最佳,湖南省石门地区最次。

LC-MS/MS法测定木通皂苷D大鼠灌胃给药的生物利用度

建立高效液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）测定大鼠灌胃给药的生物利用度.大鼠随机分为2组,分别尾静脉和灌胃给予100mg·kg^-1木通皂苷D,于不同时间点眼眶取血,用LC-MS/MS法检测血浆中药物质量浓度,计算大鼠灌胃给药的生物利用度.结果表明：木通皂苷D线性范围为10-1 000ng·mL^-1,最低定量限为10ng·mL^-1.准确度与精密度试验结果显示方法日间、日内变异均小于15%,相对偏差为-2.8%-4.6%,低、中、高3个质量浓度提取回收率为95.3%-108.1%.静脉组和口服组的药时曲线下面积AUC0-INF分别为（231 725.98±46 527.21）和（383.63±54.62）ng·h·mL^-1,灌胃给药的绝对生物利用度为0.13%.表明木通皂苷D大鼠灌胃给药生物利用度很低.

中链脂肪酸对木通皂苷D大鼠经口吸收的影响

目的考察不同碳链长度的中链脂肪酸对木通皂苷D大鼠经口吸收的影响。方法将SD大鼠随机分为5组,灌胃给予木通皂苷D水溶液,溶液中含不同种类和浓度的脂肪酸钠,每组木通皂苷D的给药剂量为100 mg/kg,各组中脂肪酸钠的给药剂量如下:不含脂肪酸、辛酸钠200 mg/kg、癸酸钠200 mg/kg、月桂酸钠200 mg/kg和癸酸钠1000 mg/kg,于不同时间点眼眶取血,用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法检测血浆中药物浓度。结果在给药后1 h内脂肪酸钠对木通皂苷D大鼠经口吸收有明显的促进作用,各组的血药浓度在给药后20 min最高,随着时间的延长迅速下降;剂量为200 mg/kg时,辛酸钠对木通皂苷D大鼠经口吸收促进作用最强。1000 mg/kg癸酸钠对木通皂苷D大鼠经口吸收促进作用较200 mg/kg强,且木通皂苷D血药浓度随着时间延长下降得更为缓慢。结论碳链为8(辛酸钠)、10(癸酸钠)和12(月桂酸钠)的脂肪酸盐对木通皂苷D大鼠经口吸收有明显的促进作用,癸酸钠给药剂量的提高有利于其经口吸收促进作用的维持。

木通皂苷D在不同pH值和温度下的稳定性

目的研究木通皂苷D在不同的pH值和温度下的稳定性。方法采用高效液相色谱法测定不同pH值的磷酸盐缓冲液中木通皂苷D浓度。结果方法的精密度(相对标准偏差,RSD)≤6.4%,准确度(相对误差,RE)≤±4.7%。木通皂苷D在中性和弱碱性的环境中比较稳定,但在强酸和碱性环境中易分解,其降解速率还随温度的升高而加快。结论试验表明木通皂苷D的降解具有pH值和温度依赖性,其在室温条件下的稳定性可以满足分析测定的需求。

负载木通皂苷D的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架修复骨缺损

背景:木通皂苷D具有促进成骨细胞的增殖与分化、提高成骨细胞活性与数量、促进基质钙化与骨痂生长等诸多作用,主要被用于治疗骨质疏松与促进骨折愈合,将其应用于骨缺损修复的研究较少见。目的:以纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架为载体,将包裹木通皂苷D的缓释微球负载于其中,观察其骨缺损修复作用。方法:采用W/O/W方法制作包裹木通皂苷D的缓释微球,采用冷冻干燥方法制备负载包裹木通皂苷D缓释微球的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架(以下简称缓释支架)与单纯的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架(以下简称空白支架),检测缓释微球与缓释支架的体外释药能力。将小鼠来源前成骨细胞MC3T3-E1分别接种于两种支架上,以单独培养的细胞为对照,分析细胞的黏附、增殖与分化情况。在24只成年新西兰大白兔双侧桡骨中段制造1.5 cm的骨缺损,分别植入空白支架与缓释支架,术后4,12周时进行大体观察、Micro-CT扫描影像学检查及组织学观察。结果与结论:①包裹木通皂苷D的缓释微球与缓释支架均具有缓释作用,其中缓释支架的药物释放速率更加平稳、持久;②CCK-8实验显示,缓释支架上的细胞增殖速率快于空白支架、对照组(P<0.05);扫描电镜下可见,小鼠来源前成骨细胞MC3T3-E1覆盖在两组支架表面,其中缓释支架上的细胞数量要多于空白支架;③培养7,14 d时,缓释支架组的碱性磷酸酶活性、Runx2 mRNA表达高于空白支架组(P<0.05);培养第21天时,缓释支架组的骨桥蛋白、骨钙素蛋白表达量高于空白支架组(P<0.05);④影像学检查与组织学观察结果显示,术后4周时,缓释支架组材料周围可见大量的新生骨,其新生骨量明显多于空白支架组;术后12周时,缓释支架内部也可见大量的新生骨长入,空白支架内部仅见少量的新生骨长入,并且缓释支架组的材料残余明显少于空白支架组(P<0.05);⑤结果表明,负载木通皂苷D缓释微球的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架可提升体外成骨细胞的黏附、增殖与分化能力,提升纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架的体内骨诱导能力。

川续断皂苷Ⅵ诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的研究

目的探讨川续断皂苷Ⅵ(akebia saponin D)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的影响。方法用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs,选择合适的培养基,传代扩增。采用不同浓度的川续断皂苷Ⅵ对大鼠MSCs定向诱导分化,MTT法观察各组对MSCs的增殖作用并绘制细胞生长曲线;观察MSCs诱导分化过程中成骨细胞内碱性磷酸酶(alkaliphosphatase,ALP)活性;采用ELISA法检测MSCs诱导分化过程中骨钙素(Osteo-calcin,OC)的含量;RT-PCR方法检测MSCs诱导分化过程中核心结合因子α-1(Cbfα1)mRNA表达。结果细胞生长曲线显示各组MSCs数量均随时间延长而增加,中、高浓度的川续断皂苷Ⅵ能明显提高MSCs分化为成骨细胞的ALP活性和骨钙素的含量,且使Cbfα1 mRNA的表达升高。结论川续断皂苷Ⅵ具有促进大鼠体外MSCs向成骨细胞增殖和分化的作用,这一作用可能与其升高Cbfα1 mRNA的表达有关。

高效液相色谱法测定续断药材中川续断皂苷Ⅵ的含量

目的：建立中药续断中川续断皂苷Ⅵ的含量测定方法，为续断质量标准建立提供依据。方法：采用反相高效液相色谱法，Kromasil ODS色谱柱，流动相为乙腈-水（30：70），检测波长为212nm。结果：续断中川续断皂苷Ⅵ在该色谱条件下获良好分离，线性范围为0．5825-9．32μg，r=0．9999，平均加样回收率为100．3％，重复性RSD为2．3％。结论：该方法方便，快速，准确，可作为续断药材及其制剂质量控制的方法。

续断皂苷活性成分的综合评价研究

目的:建立续断皂苷活性成分的综合评价方法,为完善续断活性成分的质量控制方法提供参考。方法:以续断皂苷单一成分木通皂苷D和大类成分总皂苷的含量为指标,分别采用高效液相色谱法及比色法进行测定,以各指标的权重系数为0.5进行评分,以2个指标的得分之和作为综合评分,以此来评价续断皂苷类活性成分质量。结果:4个产地共13个批次的木通皂苷D和总皂苷含量几乎无相关性(r=0.046),单一指标难以有效评价续断皂苷活性成分。综合评分法较全面的反映了续断皂苷活性成分的质量。结论:综合评分法克服了单一指标质控方法的片面性,用于控制续断质量具有合理性。

续断皂苷抗白血病作用的机制探讨

目的探讨续断皂苷(akebia saponinD,ASD)抗白血病细胞及其作用机制。方法用不同剂量(10、30、50、100μg/mL)皂苷处理人急性白血病细胞株U937细胞和人早幼粒白血病细胞株HL-60细胞,采用MTT比色法观察ASD对白血病细胞的作用。以Annexin-Ⅴ染色法检测细胞凋亡并以PCR法检测凋亡相关基因的表达。采用Westernblot法检测P53蛋白的变化。采用Griess分光光度法检测样品中一氧化氮(NO)的代谢产物亚硝酸盐的含量。结果与未处理组相比,50μg/mLASD能明显抑制U937细胞和HL-60细胞的生长并呈剂量依赖性,同时伴随bcl-2mRNA表达的明显下调。Western blot检测结果显示,P53蛋白的表达水平随ASD作用而升高。另外,ASD可以促使U937细胞和HL-60细胞中NO的含量显著提高(P<0.05)。结论 ASD对U937细胞和HL-60细胞具有增殖抑制和诱导凋亡的作用,其机制与bcl-2基因的下调,p53蛋白上调,以及促进白血病细胞内NO含量提高相关。

HPLC法测定大鼠血浆中川续断皂苷VI的浓度

目的:建立了高效液相色谱测定大鼠血浆中川续断皂苷VI浓度的方法。方法:血浆样品经甲醇沉淀蛋白后,采用HPLC法测定。色谱柱为Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-甲醇-水(32:17:51,v/v);检测波长205nm;柱温为室温;流速1.0mL·min-1。动物实验使用Wistar大鼠6只,采用腹腔注射给药(55mg·kg-1),进行血药浓度测定和药动学参数计算。结果:大鼠血浆内源物质对药物测定无干扰,在血药浓度5.0～500.0μg·mL-1范围内,浓度对峰面积有良好的线性关系(r=0.9946),定量下限为5.0μg·mL-1;低、中、高3种浓度样品的回收率分别为85.0%、83.6%和86.6%,平均为85.0%;日内、日间精密度RSD均小于7.8%(n=9)。采用非房室模型分析方法进行数据处理,所得参数符合药物动力学变化趋势。结论:该法准确、简便,可用于川续断皂苷VI在大鼠血浆中的浓度测定和药物动力学研究。

三七活血通络贴的定性定量分析

目的对三七活血通络贴进行定性定量分析。方法采用薄层色谱法对三七、小茴香、乳香、秦艽、续断、川牛膝、冰片进行定性鉴别。采用高效液相色谱法测定样品中川续断皂苷Ⅵ的含量,采用气相色谱法测定样品中龙脑的含量。结果各薄层色谱中,在与对照品相应的位置上显相同颜色的斑点,阴性对照未见干扰。川续断皂苷Ⅵ在0.3～1.5μg范围内具有良好的线性关系,r=0.999 9,平均加样回收率为99.17%;龙脑在0.14～0.70μg范围内具有良好的线性关系,r=0.999 7,平均加样回收率为98.78%。结论定性定量检测方法简便,结果准确,重复性好,可用于三七活血通络贴的质量控制。

根痛平胶囊和根痛平片中川续断皂苷Ⅵ的含量测定方法研究及续断的投料情况分析

目的建立根痛平胶囊和根痛平片中川续断皂苷Ⅵ的含量测定方法,监测生产企业续断投料情况。方法采用高效液相色谱(HPLC)法,Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以乙腈-水(27∶73)为流动相等度洗脱,流速1.0 mL·min-1,检测波长为212 nm。结果川续断皂苷Ⅵ在30~280μg·mL-1的范围内呈良好的线性关系,回归方程为Y=2 029.357 0 X+3.688 5,R2=0.999 7,平均回收率为96.08%,RSD为1.01%。结论该法简单准确,可用于测定根痛平胶囊和根痛平片中川续断皂苷Ⅵ的含量,为根痛平系列制剂的质量标准提高提供理论依据;制定了川续断皂苷Ⅵ含量参考限度值,考察企业续断的投料情况,提示个别企业未投料或投料用续断质量差。

木通皂苷D原料中有机溶剂残留量及大孔树脂有机残留物的测定

该研究根据药品注册的国际技术要求（ICH）、《中国药典》及国家食品药品监督管理总局《关于＂大孔吸附树脂分离纯化中药提取液的技术要求＂的补充说明》对残留有机溶剂和大孔树脂有机残留物的规定,采用顶空气相色谱法测定木通皂苷D原料中正己烷、乙酸乙酯、乙醇、苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、苯乙烯、二乙基苯和二乙烯苯的残留量。以FID为检测器,高纯氮为载气,上述11种被测物在DB-wax固定相的开口毛细管柱中得到较好的分离,分析方法经验证,各被测成分在一定浓度范围内呈良好线性关系（0.999 2~0.999 7）,重复性好（RSD〈10%）,平均回收率为80.0%~110%,各成分的检出限远低于限度浓度。该方法准确快捷,灵敏度高,适用于木通皂苷D原料中残留有机溶剂及大孔树脂有机残留物的检查。

木通皂苷D对CCl_4致小鼠急性肝损伤的保护作用

目的研究木通皂苷D对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用。方法采用CCl4急性肝损伤模型,小鼠ig给予不同剂量的木通皂苷D(1、0.5、0.25 g·kg-1),并以水飞蓟素(0.2 g·kg-1)为阳性对照药,采用比色法检测小鼠血清的天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及肝脏中还原性谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量。结果各剂量木通皂苷D能显著降低CCl4所致小鼠血清中AST、ALT的水平(P<0.01),同时升高肝脏组织中GSH、SOD的水平(P<0.05),降低肝脏组织中MDA的含量(P<0.05)。结论木通皂苷D对CCl4所致小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用,其机制可能与抗氧化作用有关。

木通皂苷D对Aβ诱导损伤的PC12细胞修复作用

目的:研究木通皂苷D对Aβ诱导损伤的PC12细胞修复作用及相关基因表达水平的影响。方法:采用MTT法测定木通皂苷D对Aβ诱导损伤的PC12细胞修复作用,采用实时荧光定量PCR仪测定木通皂苷D对A2M、ECE2基因表达的影响。结果:在15μmol.L-1的浓度下,在6,12,24,48 h时间点,Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的抑制率与空白组相比,差异均有极显著性(P<0.01),且24 h时抑制率最高。木通皂苷D在不同给药时间逐渐表现出细胞增殖作用,且在作用16 h后产生明显的增殖效应,差异有极显著性(P<0.01);其中木通皂苷D处理24 h的细胞增殖作用最强,差异有极显著性(P<0.01)。与空白组比较,模型组中ECE2基因和A2M基因的相对表达量明显上调;木通皂苷D不同给药时间组PC12细胞中的ECE2基因和A2M基因的相对表达量与模型组相比明显下调。结论:木通皂苷D对Aβ诱导损伤的PC12细胞具有修复作用,其机制是通过下调ECE2基因和A2M基因的相对表达量修复Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤。

木通皂苷D在大鼠胃肠道内容物中的稳定性考察

为了考察木通皂苷D(akebia saponin D,ASD)在胃肠道内容物中的稳定性,建立了ASD的高效液相色谱含量测定方法,并将ASD分别溶解在人工胃液、人工肠液、胃内容物、大肠内容物、小肠内容物中,37℃恒温水浴,孵育一定时间后取样,测定ASD的浓度。结果 ASD在大肠内容物中极不稳定,8 h以内被全部降解。ASD在人工胃液、人工肠液、胃内容物和小肠内容物中非常稳定。上述结果证明ASD在酸性环境下、酶的存在下以及在小肠菌群中均稳定,而在大肠菌群的作用下极易降解。

木通皂苷D对神经酰胺诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用研究

目的探讨木通皂苷D(ASD)对神经酰胺诱导的肺上皮细胞凋亡及小鼠急性肺损伤的影响。方法将BEAS-2B细胞接种于96孔板,培养12 h后将细胞分为空白对照组、模型组和低、中、高剂量实验组。空白对照组加入等量二甲亚砜(DMSO);模型组加入40μmol·L^(-1)C6-神经酰胺;低、中、高剂量实验组分别加入50,100和200μmol·L^(-1)ASD,2 h后加入40μmol·L^(-1)C6-神经酰胺。用CCK-8检测细胞活力。实验小鼠随机分为对照组、模型组和实验组,每组5只。对照组和模型组小鼠腹腔注射给予0.9%NaCl;实验组小鼠每天腹腔注射给予300 mg·kg-1 ASD,连续给药7 d。末次给药后2 h,模型组和实验组直接气管滴入C6-神经酰胺建立急性肺损伤小鼠模型。用Bradford法检测肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量。结果在细胞实验中,低、中、高剂量实验组和模型组、空白对照组的细胞活力分别为(72.21±4.14)%,(77.20±3.33)%,(88.61±1.30)%,(62.95±5.16)%和(100.00±0)%,低、中、高剂量实验组细胞活力与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。在动物实验中,实验组、模型组和对照组BALF中蛋白浓度分别为(0.46±0.13),(0.71±0.12)和(0.32±0.15)mg·mL^(-1),实验组BALF中蛋白浓度与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论ASD能够抑制肺上皮细胞凋亡,缓解神经酰胺诱导的急性肺损伤的发生发展。