水貂阿留申病毒地方强毒株ADV-LN的分离鉴定

本研究采用对流免疫电泳方法(CIEP)检测辽宁水貂养殖场疑似水貂阿留申病毒(aleutian mink disease virus,ADV)水貂血清抗体,采集抗体阳性水貂的肝脏、脾脏、肾脏和肠系膜淋巴结组织,电镜观察存在细小病毒样颗粒。组织液研磨无菌处理后,接种CRFK细胞,盲传6代,取病毒细胞分离液用PCR方法检测,呈ADV阳性。将病毒分离液纯化后接种健康水貂,隔离观察,接种后3d即出现食欲减退,贫血,被毛无光泽,后期出现拒食、狂饮、死亡,个别水貂出现神经症状,表现抽搐、痉挛、步态蹒跚、共济失调,证明分离获得的病毒为ADV强毒株,命名为ADV-LN株。

水貂阿留申病毒的微滴式数字PCR方法的建立及初步应用

为建立水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法,本研究根据AMDV VP2基因的保守区设计特异性引物和探针,通过PCR扩增AMDV VP2基因并克隆至p MD19-T载体,构建重组质粒p MD19-T-AMDV,并经PCR和测序鉴定后利用该质粒标准品作为模板,通过各反应条件的优化,初步建立了检测AMDV的ddPCR方法。分别以AMDV、水貂肠炎细小病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、水貂流感病毒基因组为模板,按照本研究建立的ddPCR方法检测,评估其特异性;将1.43×10^(7)拷贝/μL~1.43×10^(0)拷贝/μL的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR和文献中的荧光定量PCR (qPCR)检测,评估该方法的敏感性;分别以不同浓度的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR分别进行批内和批间重复性试验,以变异系数(CV)评估该方法的重复性。优化结果显示,该方法的最佳引物终浓度为400 nmol/L (1.2μL)、探针终浓度为200 nmol/L (0.6μL)、退火温度为60℃。特异性试验结果显示,该方法仅可检测到AMDV和质粒标准品,而其他相关病毒均为阴性结果。敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品的检测限为1.43拷贝/μL,qPCR对质粒标准品的检测限为1.43×10^(2)拷贝/μL,前者比后者的敏感性高100倍。重复性试验结果,批内和批间重复性试验的变异系数均小于3%。对采集的70份病貂肝脏、脾、肾脏、环境拭子、肛拭子样品进行ddPCR和qPCR检测,结果显示,ddPCR对AMDV的检出率为24.28%(17/70);qPCR的检出率为15.7%(11/70),二者的阳性符合率为64.7%,阴性符合率为89.83%,总符合率为91.42%。上述结果表明,本研究建立的ddPCR方法特异性强、敏感性高和重复性好,可以检测各种临床样品及含量极低样品中的AMDV,为AMDV早期感染的检测、流行病学调查及AMD的防控提供有力技术手段。

水貂阿留申病毒微滴式数字PCR检测方法的建立与应用

为建立一种准确且灵敏的水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR检测方法(dd PCR),本研究根据AMDV-G基因保守区,设计特异性引物及探针,并对反应条件进行优化,初步建立检测AMDV的dd PCR方法。同时对该方法的特异性、敏感性和重复性进行分析。结果显示,dd PCR的退火温度为55℃,最佳引物和探针终浓度均为10μmol/μL。绘制的标准曲线结果显示,核酸标准物质稀释倍数的对数与对应检出拷贝数的对数之间呈良好的线性关系(R^(2)=0.9945>0.99)。建立的dd PCR方法的特异性强,除能检测到AMDV以外,对相关病原如水貂犬瘟热病毒、犬细小病毒、貂肠炎病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒I型、狂犬病毒的检测结果均为阴性。对AMDV核酸标准物质的检测限为6.2拷贝/μL,敏感性高,比荧光定量PCR(q PCR)敏感性高10倍。对不同稀释度AMDV核酸标准物质的批内和批间重复性试验的变异系数均<5%,重复性好。采用建立的dd PCR方法和荧光定量PCR方法对貂场采集的40份水貂脏器组织样品进行检测,两种检测结果基本一致,但dd PCR敏感性更高。上述结果表明,本研究建立了一种特异性强、灵敏度高、重复性好的AMDV定量检测方法,为水貂阿留申病毒的有效防控提供技术支持。

水貂阿留申病毒结构蛋白与非结构蛋白在疾病诊断与疫苗研发中的应用

水貂阿留申病是由水貂阿留申病毒引起的一种持续感染性疾病,危害毛皮动物养殖业的发展。水貂阿留申病毒的致病特点、免疫机制等与其他细小病毒不同,存在自身的复杂性。目前,众多研究者寻求新的疫苗来预防水貂阿留申病的发生,但没有取得理想的效果。疾病诊断及疫苗研发对防控水貂阿留申病具有积极的意义。水貂阿留申病毒结构蛋白在病毒感染、机体免疫过程中发挥关键作用,而非结构蛋白在病毒转录与复制过程中有着重要作用,疾病的诊断和疫苗的研发均在二者的基础上展开。应用水貂阿留申病毒结构蛋白与非结构蛋白建立新的水貂阿留申病毒诊断方法,研发新型基因工程疫苗,对控制水貂阿留申病的发生与传播,具有重要的意义。

水貂阿留申病毒纳米PCR检测方法的建立与初步应用

为建立便捷、灵敏的水貂阿留申病病毒（AMDV）纳米PCR检测方法,根据AMDV NS1基因的保守序列设计一对特异性引物,对纳米PCR反应的退火温度、胶体金浓度进行了优化;测序检测扩增基因是否发生变异;对特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,此纳米PCR的最佳退火温度为51℃,普通PCR为55℃;加入胶体金最佳浓度在0.2~0.8nmol·L-1,纳米PCR与普通PCR产物测序相似性大于99%。特异性检测表明该纳米PCR方法只扩增AMDV而不能扩增犬瘟热病毒和水貂肠炎细小病毒。在粪尿样品检测中该纳米PCR敏感性比普通PCR高10倍。检测40份临床样品,结果表明该方法比对流免疫电泳检测敏感性提高,从而为用粪、尿等低病毒样品检测水貂阿留申病提供了一种新的有效方法。

水貂阿留申病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)基因序列(GenBank登录号:NC_001662.1)设计1对特异性引物,通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了检测AMDV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,该方法的灵敏度达10拷贝/μL,≥102拷贝/μL具有良好的特异性和重复性。同时利用该方法对8份疑似AMDV血清进行检测,结果6份阳性,阳性率为75%。本研究为水貂阿留申病的鉴别诊断及净群根除奠定了技术基础。

水貂阿留申病毒结构蛋白与非结构蛋白的研究进展

水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,ADV)是一种主要侵染水貂的自主复制型细小病毒,是一种在水貂中广泛存在的重要病原体。病毒粒子的蛋白分为结构蛋白(VP1、VP2)和非结构蛋白(NS1、NS2)两类。VP1蛋白对病毒粒子产生感染性有重要作用;VP2蛋白是主要免疫功能区,能刺激机体产生中和抗体;NS1和NS2主要参与病毒的复制和基因的表达调节。文中对近年来国内外学者关于水貂阿留申病毒结构蛋白和非结构蛋白的研究情况进行归纳和总结。

水貂阿留申病病毒分子生物学研究进展

水貂阿留申病病毒是一种在水貂中广泛存在的重要病原体。该病毒属阿留申病毒属,主要编码4种蛋白(结构蛋白VP1、VP2和非结构蛋白NS1、NS2)。VP1蛋白在协助病毒产生感染性方面起着重要作用;VP2蛋白是该病毒的主要免疫原性抗原,能体外中和病毒;NS1和NS2对病毒在宿主细胞中的复制起重要的调节作用。该病毒的分子生物学诊断技术主要有核酸杂交技术、PCR和基因芯片检测技术。

水貂阿留申病毒结构蛋白和非结构蛋白研究进展

水貂阿留神病毒是一种在水貂中广泛存在的重要病原体。该病毒属阿留申病毒属,主要编码4种蛋白(VP1、VP2、NS1、NS2)。VP1蛋白在协助病毒产生感染性方面起着重要作用;VP2蛋白是该病毒的主要免疫原性抗原,能体外中和病毒;NS1和NS2对病毒在宿主细胞中的复制起重要的调节作用。为此,综述了国内外关于水貂阿留申病毒结构蛋白和非结构蛋白的研究情况,以期为该病的进一步研究提供参考。

水貂阿留申病毒、肠炎病毒与犬瘟热病毒多重PCR检测方法的建立与应用

目的水貂阿留申病、病毒性肠炎与犬瘟热并称影响水貂健康的三大疫病,拟建立一种可同时检测三种病毒的多重PCR检测方法。方法针对三种病毒基因保守区分别设计了3对特异性引物,对貂阿留申病毒(ADV)和水貂肠炎病毒(MEV)的DNA模板和犬瘟热病毒(CDV)的RNA模板进行了多重PCR扩增和扩增条件优化。结果 PCR可同时扩增出601 bp(ADV)、205 bp(MEV)和451 bp(CDV)的特异性目的条带,敏感性试验表明最低核酸检出量为ADV每微升2.67×10~4拷贝、MEV每微升3.02×10~4拷贝和CDV每微升1.72×10~5拷贝。临床样品检测结果表明多重PCR和单一PCR检测结果一致。结论建立的多重PCR检测方法可快速地检测ADV、MEV和CDV单一或混合感染的临床样品。

水貂阿留申病毒的分子生物学研究进展

从水貂阿留申病毒(ADV)基因组特点出发,就阿留申病毒的分子生物学研究进展作以简单综述。

貂阿留申病病毒结构蛋白VP1基因分子特征分析

目的研究貂阿留申病病毒（ADV）结构蛋白vPl基因分子空间结构特征，探讨貂阿留申病病毒致病机制。方法根据Genbank公布的全基因序列设计三对引物，PCR扩增并克隆到pMD．18T载体，阳性重组质粒鉴定、测序验证，拼接后进行生物信息学分析。结果获得了全长2064bpVP1基因，编码688个氨基酸；与细小病毒属中PPV—Nanjing 200801相似性最大（51．2％）；遗传进化树显示该基因编码蛋白与细小病毒属VP1亲缘关系最近。该蛋白是一种保守不合信号肽的外膜蛋白，具有7个潜在的N．糖基化位点和34个磷酸化位点。二级结构分析显示无规则卷曲含量最高，达68．75％，a螺旋、B折叠分别为16．42％和14．83％；同源建模比对，构建了具有较高合理性和可靠性的三维空间结构。结论预测抗原表位主要位于肽链第254-265、96-112、317-348、514-523、629-645位区段，可为今后开展基因工程疫苗研究奠定基础。

水貂阿留申病毒VP2基因高变区的多变性分析

为了了解青岛地区水貂阿留申病毒(ADV)VP2基因高变区的变异情况,试验参考基因库中ADV VP2基因设计1对引物,利用PCR技术扩增VP2基因高变区序列,应用DNAMAN进行序列分析和同源性比较。结果表明:扩增的6株ADV VP2基因高变区碱基长度均为226 bp,与预期目的条带大小一致。6株ADV VP2基因高变区核苷酸同源性为92.9%~100%,与已知国内外12株ADV VP2基因高变区相比核苷酸同源性为86.7%~97.3%。其中除2株基因序列完全相同外,其他4株都有很大的突变,与国内外毒株也有较大的差异,表明ADV VP2基因具有多变性。

水貂阿留申病病毒VP2截短基因的原核表达

为获得水貂阿留申病病毒G株(ADV-G株)VP2截短基因表达的蛋白,将ADV-G株VP2基因的主要抗原区片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,通过不同浓度的IPTG,不同诱导时间以及加入不同的化学分子伴侣(甘油、葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜、乙醇)进行诱导表达,确定目的蛋白表达的最佳条件。经SDS-PAGE和Western blot分析,表明终浓度为1mmol/L的IPTG诱导6h目的蛋白的表达量最高,分子质量约为53ku。SDS-PAGE分析表明,葡萄糖和乙醇抑制了目的蛋白的表达,而蔗糖、甘油和二甲基亚砜提高了目的蛋白的表达量,获得的目的蛋白具有良好的反应原性。

水貂阿留申病毒体外中和试验的研究

首次应用乙醚处理的阿留申病毒（Ａｌｅｕｔｉａｎｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ，ＡＤＶ）Ｇ株（ＡＤＶ－Ｇ）与阿留申病毒阳性血清进行体外中和试验获得成功。试验证明，经乙醚处理后ＡＤＶ抗原决定簇充分暴露，使ＡＤＶ能有效地被特异性抗体中和。水貂在感染ＡＤＶ１０天即可产生中和抗体，６０天中和抗体滴度高达１２８００。乙醚处理的ＡＤＶ－Ｇ可被兔抗ＡＤＶ结构蛋白标准阳性血清和纯化的抗ＡＤＶＦａｂ片段所中和，说明ＡＤＶ中和抗原决定簇主要位于结构蛋白上。比较了对流免疫电泳（ＣＩＥＰ）、免疫组织化学法（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｔｒｙ，ＩＨＣ）和γ－球蛋白含量测定的结果，证明中和试验是诊断阿留申病最敏感的方法。同时，阐明了各检测方法间的相关性。

水貂阿留申病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感检测水貂阿留申病毒(AMDV)的方法,本研究根据AMDV的VP2基因保守区设计特异性引物和MGB探针,并优化检测反应条件,建立了AMDV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示,以重组质粒为标准品建立的标准曲线在1.0×10~2拷贝/μL^1.0×10~8拷贝/μL内具有良好的线性关系,相关系数(R^2)为0.998。该方法仅对AMDV的靶基因扩增呈阳性,而对猪细小病毒、犬细小病毒、水貂肠炎细小病毒等相关病毒检测结果均为阴性,特异性良好。该方法对AMDV检测的灵敏度为10拷贝/μL,为普通PCR灵敏度的100倍;组内和组间重复性试验表明该方法的组内和组间变异系数均小于2%,具有良好的重复性。应用建立方法和普通PCR方法分别对40份疑似临床组织病料样品进行检测,该方法检出率比普通PCR高约7.5%。本研究结果表明建立的AMDV TaqMan-MGB荧光定量PCR方法灵敏、快速、特异性强、重复性好,适用于对AMDV的快速定量检测。

水貂阿留申病毒诱导CrFK细胞凋亡信号通路的研究

本实验室前期研究表明水貂阿留申病毒(AMDV)G株感染猫肾细胞(CrFK)可以引起其凋亡,为研究AMDV在体外通过何种途径诱导CrFK细胞的凋亡,本实验采用MOI 1的AMDV G株感染CrFK细胞,于感染后不同时间(2 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h,下同)通过分光光度法检测试剂盒检测Caspase-8、Caspase-9的活性;利用western blot检测Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达情况。采用Caspase-8和Caspase-9抑制剂处理CrFK细胞后感染AMDV G株,于不同时间检测Caspase-3的活性。于AMDV G株感染CrFK细胞后不同时间,利用荧光定量PCR检测细胞中死亡受体通路分子Caspase-8、Fas、FasL和线粒体通路分子Caspase-9、Bax、Bcl-2、Cyt C以及凋亡执行因子Caspase-3的mRNA转录水平;采用JC-10线粒体膜电位试剂盒检测各时间点细胞线粒体膜电位的去极化情况。结果显示,AMDV G株感染CrFK细胞后不同时间Caspase-8的活性均无明显变化,而Caspase-9的活性则随感染时间的延长而明显增强;western blot结果显示,Caspase-8蛋白的表达不受影响,而Caspase-9在AMDV感染后12 h被切割活化。Caspase-3活性的检测结果显示,抑制CrFK细胞中Caspase-8的活性后再感染AMDV,Caspase-3的活性逐渐增强,而抑制细胞中Caspase-9的活性后再感染AMDV,则Caspase-3的活性无明显变化,即抑制了Caspase-9再感染AMDV并不能诱导细胞凋亡;荧光定量PCR结果显示,AMDV感染CrFK细胞后不同时间Caspase-8、Fas、FasL基因的转录水平均无明显变化,而Caspase-9、Caspase-3、Cyt C基因mRNA转录水平及Bax/Bcl-2的比值则随感染时间的延长而逐渐升高。线粒体膜电位结果显示,AMDV感染的CrFK细胞线粒体膜电位下降,发生了明显去极化现象,表现为细胞发生了凋亡。综上,本研究首次证实AMDV G株感染CrFK细胞后激活了线粒体途径的细胞凋亡执行分子Caspase-3及线粒体通路相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-9和Cyt C,并未激活死亡受体通路相关分子,AMDV G株是通过激活细胞线粒体通路而诱导CrFK细胞的凋亡。本研究为AMDV感染CrFK细胞凋亡机制的研究奠定了基础。

水貂阿留申病诊断技术研究进展

水貂阿留申病是水貂养殖业的重要疫病,目前无疫苗预防,主要通过发展诊断技术,淘汰感染貂防控该病。论文总结了在貂场应用的基因与抗体检测技术,基因检测具有高灵敏度和特异性,能够检测到动物带毒感染,不同类型的基因检测技术对变异性强的阿留申病毒检测各有所长;抗体检测是水貂阿留申病的主要检测方式,研究者不断创新和改进原有技术,趋向对阿留申病的规模化精准检测,但单一的抗体检测方法淘汰感染貂具有局限性。论文通过对两类检测技术分析,建议采用基因与抗体的联合检测方法,从感染貂群中区分耐受貂或抗性貂,期望为国内高感染率貂场的检测和选种提供参考。

水貂阿留申病病毒研究进展

水貂阿留申病(Aleutian mink disease,AMD)是由水貂阿留申病病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)引起的水貂的重要传染性疾病之一,深入开展对AMDV的研究对于该病的防控有重要意义。AMDV基因组全长约为4.8 kb,主要编码2种结构蛋白和3种非结构蛋白,它们在病毒复制、增殖及致病过程中发挥重要作用。AMDV的复制依赖于代谢活跃的细胞,对于幼貂,病毒感染肺泡Ⅱ型细胞会造成急性致死性肺炎,感染巨噬细胞则会引起成年水貂患高丙种球蛋白血症和免疫复合物介导的肾小球肾炎等慢性进行性疾病。笔者从AMDV侵入细胞的受体途径、诱导细胞凋亡途径及病毒复制等方面对其致病机理进行阐述。AMDV在全世界范围内广泛流行,现有的检测方法主要分为血清学诊断方法和分子生物学诊断方法。目前,尚未开发出安全有效的针对AMDV的商品化疫苗,随着生物学技术的快速发展,在灭活疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗的研制上有所进展;抗病毒的新方法,如筛选AMDV耐受貂,提高水貂免疫力和靶向适配体技术为AMD的防控提供了新思路。文章从AMDV编码蛋白功能、病毒细胞嗜性与复制、临床表现与致病机制、诊断方法及防治措施等方面对近年来国内外AMDV的研究进展进行总结,旨在为AMDV安全有效疫苗和防治药物的研发提供参考。

水貂阿留申病毒5个分离株的全基因测序及遗传变异分析

流行病学调查表明,水貂阿留申病是严重危害水貂养殖业的3大疫病之首。迄今为止,尚未开发出能有效防控水貂阿留申病的疫苗。本试验根据GenBank上公布的不同水貂阿留申病毒(ADV)毒株的基因序列,设计并合成了12对引物,对吉林农业大学经济动物疾病实验室已分离和鉴定且具有致病性的5株水貂阿留申病毒野毒株进行全基因测序,并将测序结果与ADV参考毒株及细小病毒亚科各属代表种的全基因序列进行核苷酸序列分析及同源性比较。结果表明,所分离5株病毒基因组大小分别为4 537、4 539、4 562、4 572、4 569bp。同源性分析结果显示,分离的5株ADV毒株与欧美毒株ADV-G、ADVUtahl、ADV-SL3的核苷酸同源性最低为92.8%,最高为97.6%。通过DNA Star软件对5株ADV的VP2核苷酸推导的氨基酸序列分析可知,所分离的5个毒株中,有61个氨基酸发生突变。ADV-DL124和ADV-DL125与ADV-G株相同,在26-35位处缺失9个氨基酸,同时在36位缺失1个氨基酸(甘氨酸)。对这些改变位点的研究可为水貂阿留申病的致病机理及水貂阿留申病基因疫苗的构建积累资料。