ALK-3、Pax-8基因抑制后大鼠心肌细胞中Smad1/5/8的表达

目的:抑制大鼠胚胎心肌细胞株中ALK-3、Pax-8基因的表达后,探索Smad1/5/8在其中所起的作用。方法:将H9C2(2-1)大鼠胚胎心肌细胞分为4组:针对Pax-8基因的小干扰RNA(Pax-8 siRNA)组、ALK-3基因的小干扰RNA(ALK-3 siRNA)组、阴性对照(NC siRNA)组和空白对照组。前3组分别给予相应siRNA(5.0μL)和Lipofectamine 2000(5.0μL)配制成的siRNA-脂质体复合物溶液,空白对照组给予等量的细胞培养基。采用qRT-PCR测定Pax-8和ALK-3的mRNA表达,Western blot法检测磷酸化Smad1/5/8(p-Smad1/5/8)和半胱天冬酶(Caspase)-3表达。结果:与NC siRNA组和空白对照组比较,Pax-8 siRNA组的Pax-8 mRNA表达分别下调50%(P<0.05)和54%(P<0.05),ALK-3 siRNA组的ALK-3 mRNA表达分别下调49%(P<0.05)和53%(P<0.05),而NC siRNA组与空白对照组间差异无统计意义(P>0.05)。与NC siRNA组和空白对照组比较,ALK-3 siRNA组p-Smad1/5/8的蛋白表达量分别下调58%(P<0.05)和55%(P<0.05),Pax-8 siRNA组p-Smad1/5/8的蛋白表达量差异无统计意义(P>0.05)。NC siRNA组与空白对照组间差异无统计意义(P>0.05)。与NC siRNA组和空白对照组比较,Pax-8 siRNA组Caspase-3蛋白表达量分别上调76%(P<0.05)和81%(P<0.05),ALK-3 siRNA组Caspase-3的蛋白表达量分别上调135%(P<0.05)和140%(P<0.05),而NC siRNA组与空白对照组间差异无统计意义(P>0.05)。结论:在大鼠胚胎心肌细胞株中对基因ALK-3、Pax-8干扰后能引起细胞凋亡蛋白Caspase-3明显增多,并且在ALK-3 siRNA组发现Smad1/5/8蛋白磷酸化减少,而Pax-8 siRNA组中未发现Smad1/5/8磷酸化减少,提示Smad1/5/8在基因ALK-3被干扰后引起细胞凋亡蛋白Caspase-3增多中起重要作用。

丹芪合剂对DM大鼠肾小管BMP-7及其受体表达的影响

目的观察丹芪合剂和依那普利对糖尿病(DM)大鼠肾小管上皮细胞骨形态发生蛋白-7(BMP-7)及其受体ALK-3表达的影响,探讨丹芪合剂的药理机制。方法将SD大鼠分为正常对照组(A组)、糖尿病组(B组)、糖尿病丹芪合剂组(C组)和糖尿病依那普利组(D组)。以链脲佐菌素复制DM大鼠模型。于实验12周处死大鼠后测定相应生化指标和肾脏指数,PAS染色观察肾组织的形态结构变化;免疫组化检测肾小管上皮细胞BMP-7和FN蛋白的表达;RT-PCR方法检测肾皮质BMP-7和ALK-3 mRNA水平。结果①B组的血糖、甘油三酯和总胆固醇、血肌酐、肾脏指数均显著高于A组并出现明显的蛋白尿,C和D组上述指标除血糖外均明显低于B组。②免疫组化结果显示BMP-7蛋白高表达于A组肾小管上皮细胞胞浆,FN仅有少量表达;B组BMP-7蛋白的表达明显减少,FN表达却明显增多;C和D组肾小管上皮细胞BMP-7蛋白表达显著高于B组,但低于A组,同时FN的表达减少。③RT-PCR结果显示,与A组相比,B组肾皮质BMP-7表达明显减少,且ALK-3 mRNA未见表达,C和D组BMP-7及其受体ALK-3 mRNA表达均显著高于B组,D组ALK-3 mRNA表达甚至高于A组。结论丹芪合剂和依那普利可能通过促进内源性BMP-7及其受体ALK-3的表达,使FN的沉积减少,从而对糖尿病大鼠肾脏起保护作用。

精子发生相关基因VASA在正常和少精子症患者精子中的表达及意义

目的探讨生殖细胞高度特异性基因VASA和信号分子BMP-4在精子发生中的作用和相关机制。方法正常和少精子症患者精液通过Percoll梯度分离获得精子和未成熟生精细胞,采用RT-PCR、real-time PCR、Western Blot和免疫荧光方法分析基因转录产物表达。结果少精子症精子VASA基因转录产物是正常精子的1/5；两种样本精子中均检测到荧光信号,正常组信号强,与Western blot结果相一致；两种样本精子RT-PCR均未检测到BMP-4及其Ⅰ型受体Alk-3表达,但在分离的未成熟生精细胞中均表达。人正常睾丸组织可检测到BMP- 4及其Alk-3表达。结论少精子症患者精子发生过程中VASA基因及其产物发生变化；BMP-4及其受体Alk- 3并不直接上调VASA表达；睾丸组织包括精子所存在的部分转录产物,而精子转录产物并不完全等同于睾丸组织；睾丸组织内表达BMP-4和Alk-3的可能主要是精原和精母细胞。