水稻与油菜黄单胞菌菜豆致病变种非寄主互作体系中病原细菌过氧化氢的作用

【目的】探讨互作体系中病原菌来源过氧化氢的作用。【方法】采用组织化学法通过透射电子显微镜技术观察水稻与油菜黄单胞菌菜豆致病变种互作体系中的过氧化氢积累的定位。【结果】突变体菌株细胞中烷基过氧化物还原酶亚基C的缺失导致胞内其余过氧化氢清除酶活性的补偿性显著上升,使胞内内源过氧化氢积累水平显著下降,并引起病原菌与水稻互作体系中的过氧化氢积累水平发生显著变化。【结论】病原细菌很可能是互作体系中过氧化氢的一个重要来源。病原细菌产生的过氧化氢很可能在非寄主互作中造成细菌周围植物细胞的损伤,对植物细胞具有潜在的毒性。

沙眼衣原体Ahpc蛋白的原核表达、纯化及活性分析

本研究根据Ct Ahpc基因序列设计特异性引物,以Ct DNA为模版PCR扩增Ahpc基因到大小为585 bp,将其连接到p ET28a获得重组质粒p ET28a-Ahpc,将该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌BL/p ET28a-Ahpc,利用IPTG诱导重组Ahpc蛋白表达,目的蛋白分子量大小约为26 k D。利用Ni-NAT亲和层析法纯化得到的重组Ahpc蛋白。氧化铁二甲酚橙法检测发现Ahpc蛋白能够分解双氧水和叔丁基过氧化氢,具有分解过氧化合物的活性。测定重组大肠杆菌在百草枯所致氧化胁迫下的生长曲线,发现表达Ahpc蛋白的重组菌的生长情况比对照好。本研究成功表达和纯化得到沙眼衣原体Ahpc蛋白并测定其活性,为解析沙眼衣原体的抗氧化机制提供实验证据。

肺炎克雷伯菌烷基过氧化氢还原酶C的表达纯化及其活性测定

目的表达、纯化肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)烷基过氧化氢还原酶C(Alkyl hydroperoxide reductase C,Ahpc)并测定其活性。方法利用Clustal Omega分析不同细菌Ahpc蛋白的同源性;利用生物信息学方法分析肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白的生物学特性。根据Ahpc基因,设计PCR引物,以肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板,PCR扩增Ahpc基因,双酶切后将其连接到pET28a,获得重组质粒pET28a-Ahpc。将重组质粒转化大肠埃希菌,使用IPTG诱导重组Ahpc蛋白的表达,使用亲和层析纯化目蛋白,采用氧化铁二甲酚橙法测定Ahpc蛋白降解叔丁基过氧化氢活性。结果肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白含有两个半胱氨酸的经典过氧氧化还原蛋白,定位在细菌细胞质,无跨膜结构域。其α螺旋、β片层以及无规卷曲的含量分别为27.8%,19.7%和52.4%。三级结构是由10个同源的Ahpc蛋白组成同源多聚体。Ahpc蛋白具有多个B细胞表位。PCR扩增得到564bp的Ahpc基因,构建的pET28a-Ahpc重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)后能表达分子质量单位约为24.7ku的重组Ahpc蛋白。亲和层析法获得纯度较高的重组Ahpc蛋白,纯化的重组蛋白能降解丁基过氧化氢。结论成功表达了肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白,该蛋白纯化后仍具有降解能够降解丁基过氧化氢的活性,为肺炎克雷伯菌的抗氧化机制研究奠定了基础。