间充质干细胞诱导糖尿病小型猪同种异体胰岛移植的免疫耐受

背景:胰岛移植为有望根治糖尿病的一种方法,而移植排斥问题阻碍了移植的开展,诱导受体对供体移植物的免疫耐受是解决同种异体移植排斥反应的关键。目的:观察骨髓间充质干细胞输注对糖尿病小型猪同种异体胰岛移植物存活时间的影响。方法:无菌条件下抽取动物骨髓,离心弃上清。取单核细胞层,洗涤后加入L-DMEM培养基,调整细胞浓度为1×109L-1。培养48h后换液去除未贴壁的细胞,依据贴壁培养法分离和扩增间充质干细胞。取第5代细胞作为移植供源,调整细胞浓度为1×1010L-1。四氧嘧啶制备糖尿病小型猪模型,随机分为骨髓细胞组和干细胞+骨髓细胞组,经肝门静脉分别植入胰岛细胞、骨髓细胞,胰岛细胞、骨髓细胞和骨髓间充质干细胞。结果与结论:骨髓间充质干细胞联合骨髓细胞输注较单纯骨髓细胞输注能显著延长同种异体小型猪胰岛移植物存活时间(P<0.05),同时受体血清胰岛素能较长时间维持较高水平。提示骨髓间充质干细胞输注能显著延长猪胰岛移植物存活时间,并促进胰岛移植物正常功能的发挥。

卵巢组织异体移植对去势模型大鼠骨质疏松的治疗作用

目的:研究卵巢组织异体移植对去势模型大鼠骨质疏松的治疗作用及其机制。方法:将40只SD雌性大鼠随机分为假手术组、去卵巢模型组,雌激素组和卵巢组织块移植组。采用背部定位切除双侧卵巢,建立去势大鼠模型。造模的同时,将同种异体卵巢组织块植入去卵巢大鼠背部肌肉层以建立卵巢移植模型。雌激素组大鼠按雌激素0.06 mg/kg灌胃进行替代治疗3个月,其他各组均给予等量生理盐水。实验结束后,称量体重和子宫湿重,计算子宫重量指数;HE染色光镜观察大鼠阴道上皮细胞和股骨细胞形态;骨密度仪法检测大鼠全身、股骨和胫骨近端的骨密度;放射免疫法检测血清雌激素(E2)水平。结果:与假手术组相比,模型组大鼠子宫重量指数明显下降(P<0.01);血清雌激素水平显著降低(P<0.01);阴道上皮细胞较小,无角质化;股骨中的骨小梁数目显著减少,骨吸收明显,呈典型的"岛屿状",骨髓腔增大,髓腔中基质细胞极少;双能X线显示,模型大鼠全身、股骨和胫骨的骨密度均显著减少(P均<0.01);与模型组相比,雌激素组和移植组大鼠的子宫重量指数增加明显(P<0.01,P<0.01);两组大鼠的血清雌激素水平上升显著(P<0.01,P<0.01);病理切片显示,雌激素组和移植组大鼠的阴道上皮细胞大多呈角质化;雌激素组大鼠皮质骨增厚,骨小梁粗壮,数量多,排列较整齐,骨小梁间距较小,且骨髓腔缩小,骨基质细胞明显增多;移植组大鼠皮质骨面积较大,骨小梁数量和面积增加明显,骨小梁间距小,排列规则,连接增多,骨基质细胞分布均匀。结论:卵巢组织移植可能是通过与靶肌肉组织产生新生血管连接,不断分泌内源性雌激素,后者通过结合子宫、阴道和股骨组织中靶受体-雌激素受体,进而维持子宫和阴道等靶组织的形态与功能,并抑制骨质组织矿物质的丢失,从而达到改善或促进雌性大鼠内分泌功能的目的。

miR-378对异体移植过程中骨髓间充质干细胞存活的影响

目的:探讨miR-378对异体移植过程中骨髓间充质干细胞(BMSCs)存活的影响。方法:采用密度梯度离心法分离大鼠BMSCs(rBMSCs),流式细胞仪检测rBMSCs表面标志物CD105、CD45、CD34、CD29和CD44的表达情况,茜素红和碱性磷酸酶染色观察细胞成骨诱导分化能力。采用miR-378模拟物或抑制剂转染rBMSCs,Real-time PCR检测细胞中miR-378表达情况。使用大鼠异体血清(ARS)干预转染后的rBMSCs,采用甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡蛋白Caspase-3表达水平。Europium标记转染后rBMSCs进行大鼠尾静脉移植,观察活体内rBMSCs存活情况。结果:经鉴定所分离的细胞确定为rBMSCs。转染miR-378模拟物(或抑制剂)后,rBMSCs中miR-378的表达显著增加(或降低)(P<0.05)。ARS干预后,rBMSCs存活率显著降低(P<0.05),凋亡率显著升高(P<0.05),cleaved-caspase-3表达显著上调(P<0.05);miR-378过表达(或低表达)可显著提高(或降低)ARS干预下rBMSCs的存活率,降低(或增加)细胞凋亡率,下调(或上调)cleaved-caspase-3表达。尾静脉异体移植rBMSCs后,miR-378过表达(或低表达)可显著提高(或降低)rBMSCs在活体内的存活率(P<0.05)。结论:miR-378可显著提高异体移植过程中BMSCs的存活率,且抑制细胞凋亡。

异体骨基质明胶移植的免疫原性研究

为骨缺损寻找一种比较理想的修复材料。实验采用Ｃ５７ＢＬ／６和ＤＢＡ／２小鼠作为动物模型。对异体骨进行一系列的化学处理，制备成骨基质明胶，移植于Ｃ５７ＢＬ／６小鼠股部肌肉中，同时以异体新鲜骨和同基因新鲜骨作为阳性和阴性对照。通过观察宿主的抗体—补体介导的细胞杀伤反应和细胞介导的细胞杀伤反应，发现异体骨经过化学处理其免疫原性明显降低，与同基因新鲜骨无显著性差异（Ｐ＞０．０５），故认为异体骨基质明胶具有良好的组织相容性，并以其骨诱导性和可塑性，有可能成为骨缺损畸形比较理想的修复材料。

吻合血管的同种异体骨移植的研究现状及进展

吻合血管的同种异体骨移植(VBAT)被认为是修复大段骨缺损的较理想模式,在调控免疫排斥的情况下,异体骨的成骨细胞及骨细胞可存活并自身成骨,参与骨愈合。同时骨细胞的存活对于骨生物力学性状的维持也具有一定的作用。现就吻合血管的同种异体骨移植的解剖学基础、免疫学研究、临床应用、并发症、面临的问题等方面综述如下。

细胞因子诱导的imDCs鉴定及免疫学功能研究

目的:分析未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,imDCs)的免疫学功能,诱导同种异体复合组织移植局部免疫耐受性。方法:采用细胞因子诱导培养黏附法,取大鼠骨髓前体细胞,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子联合白细胞介素-4细胞因子诱导下培养7 d,收集贴壁细胞光学显微镜观察imDCs的形态学特征,用质量分数2%锥虫蓝染色检测活性细胞率;应用流式细胞仪分析imDCs表面标志分子;MTT比色法测定imDCs与同种异体T淋巴细胞混合培养后T淋巴细胞的增殖能力。结果:制备诱导培养的imDCs具有形态不规则、表面粗糙层叠状皱褶、胞质突起短而多、树枝样分叉明显等典型形态特征;活性细胞率高达93%;表面较特异标志分子OX62为(61.08±4.86)%,OX62阳性细胞表达CD80、CD86、组织相容性复合体-Ⅱ表达率分别为(3.56±0.73)%、(5.38±1.09)%、(6.45±0.74)%,均为较低表达;imDCs对同种异体T淋巴细胞基本无刺激增殖能力。结论:用细胞因子诱导培养黏附法取骨髓前体细胞,可较快分选出活性和纯度较高、数量足够的imDCs,为同种异体复合组织移植诱导免疫耐受防止排斥反应的研究奠定良好的基础。

早期异基因骨髓间充质干细胞局部移植修复重度碱烧伤角膜的实验研究

目的探讨结膜下异基因骨髓间充质干细胞(MMSC)移植修复重度碱烧伤角膜的可行性。方法 MMSC移植组大鼠28只(其中10只DiI标记MMSC),对照组大鼠18只。观察角膜透明度及新生血管。免疫荧光法观察角膜上皮细胞角蛋白12(CKl2)及缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达和分布。RT-PCR分析白介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)的表达。结果 4周时移植组角膜新生血管减少,透明度未见改善。角膜缘少量MMSC,未表达CK12、Cx43。角膜近中央区和中央区未见迁移的MMSC。移植组2周、4周IL-1RA高表达,2周时差异最明显。结论结膜下异基因MMSC移植可以抑止重度碱烧伤角膜新生血管的生成,可能与减轻炎症反应有关。

胸腺内注射供体BMSCs对同种异体腹部皮瓣移植排斥的影响

目的:将供体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)胸腺内注射(intrathymic injection,IT)至受体胸腺,探讨其对同种异体腹部皮瓣移植排斥的影响及机制。方法:全骨髓贴壁培养法培养并纯化BN大鼠BMSCs,流式细胞术对其表型进行鉴定。受体Lewis鼠随机分为A组(空白对照组)、B组(BMSCs组)、C组(60Coγ射线4Gy全身照射组)、D组(全身照射+BMSCs组),每组6只。各组大鼠第0天进行同种异体腹部皮瓣移植,A组移植前14天IT PBS,B组移植前14天IT供体BMSCs,C组移植前15天给予60Coγ射线4Gy全身照射,移植前14天IT PBS,D组除移植前15天4Gy全身照射外,移植前14天IT供体BMSCs。大体观察移植皮瓣存活情况并绘制生存曲线,排斥终点流式检测脾细胞调节性T细胞(Treg)比例变化,体外混合淋巴细胞反应检测受体脾淋巴细胞对供体抗原反应性变化。结果:全骨髓贴壁培养法能够很好培养出BMSCs,其P3代流式细胞术表型鉴定结果为CD11b/c、CD45阴性,CD29、CD90阳性。B组的移植皮瓣存活时间与A组相比无明显差异(P>0.05),而D组的移植皮瓣平均存活时间较C组延长3.4天,差异具有统计学意义(P<0.01),脾细胞Treg比例显著增高(P<0.01),脾淋巴细胞对供体抗原反应性显著降低(P<0.05)。结论:IT供体BMSCs联合60Coγ射线4Gy全身照射通过上调受体脾细胞Treg比例能有效降低受体脾淋巴细胞对供体抗原的反应性,显著延长同种异体腹部皮瓣移植物存活时间。