乙醇对胃癌细胞缺氧与抗凋亡蛋白的影响

目的探讨乙醇对胃癌细胞缺氧诱导因子与抗凋亡蛋白Survivin的影响。方法将人胃癌细胞BGC823分组培养,加入5%-30%终浓度的乙醇培养1-4h,并设空白对照组,提取蛋白后采用免疫印迹法检测HIF-1α蛋白及Survivin蛋白的表达。结果在BGC823细胞中HIF-1α蛋白的表达随着乙醇浓度和时间的加大而增加;Survivin蛋白表达在乙醇处理1h后随着乙醇浓度的增加表现为先增加后减少,在乙醇处理4h后随着乙醇浓度的增加反而减少。结论在胃癌细胞BGC823中乙醇通过HIF-1α途径引起细胞缺氧,通过抑制抗凋亡蛋白Survivin促进细胞凋亡。

shRNA对肺癌相关基因抑制作用的实验研究

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,研究突变型蛋白磷酸酶2A(PP2A)α催化亚基编码基因的小发夹RNA(shRNA)对人肺癌GLC-82细胞的影响。方法:根据靶基因的不同区域设计4组shRNA,采用体外转录法合成,利用阳离子脂质体转染入GLC-82细胞,孵育48小时后,观察细胞形态学改变,MTT法检测细胞的存活率,免疫印迹法检测蛋白质的表达。结果:与空白对照相比,4组shRNA作用不尽相同,其中一组shR-NA可以明显抑制细胞的增殖,出现部分细胞脱落死亡,并且抑制GLC-82细胞目的蛋白的表达。结论:成功筛选出一段能特异而高效地抑制突变型PP2Aα催化亚基基因表达的shRNA,为进一步研究该基因的功能和作用机制提供了新的手段。另外,应用RNA干扰技术可抑制突变型PP2Aα催化亚基编码基因在人肺癌GLC-82细胞中的表达,有望成为肺癌基因治疗新的研究线索。

川芎嗪抑制缺氧诱导的乳腺癌MDA-MB-435S细胞的侵袭及迁移

目的 :探讨川芎中的主要成分川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对缺氧诱导的乳腺癌细胞MDA-MB-435S迁移及侵袭的影响及可能的作用机制。方法 :构建MDA-MB-435S细胞体外缺氧模型。采用MTT法确定缺氧条件下TMP不影响MDA-MB-435S细胞增殖的浓度;免疫荧光法检测缺氧条件下TMP对MDA-MB-435S细胞形态的影响;应用Transwell小室法和划痕愈合实验观察TMP对缺氧诱导后的MDA-MB-435S细胞侵袭和迁移能力的影响。蛋白质印迹法检测TMP对转录因子缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)介导的肿瘤转移相关蛋白血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)、赖氨酰氧化酶-1(lysyl oxidase-1,LOX-1)、锌指转录因子Snail和Slug表达的影响。结果 :TMP在缺氧条件下可以明显转变MDA-MB-435S细胞的形态,减少F-肌动蛋白(F-actin)应力纤维的数量,并且可以抑制MDA-MB-435S细胞的侵袭和转移能力。初步研究发现,TMP是通过抑制缺氧条件下HIF-1α的蛋白表达,从而减少了HIF-1α转录激活的转移相关靶基因蛋白VEGF-A、LOX-1、Snail和Slug的表达以达到抑制乳腺癌细胞转移的效应。结论 :缺氧条件下TMP能抑制MDA-MB-435S细胞的转移,这可能与其下调HIF-1α及其介导的肿瘤转移相关蛋白的表达有关。TMP对于治疗缺氧诱导的乳腺癌转移具有良好的应用前景。

JMJD2C和HIF-1α在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的 探讨含十字形结构域蛋白2C （JMJD2C） 和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）在胃癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系.方法 回顾性分析2005至2007年浙江省人民医院胃肠外科收治的110例胃癌患者的临床资料,其中男78例,女32例,平均年龄57（32～79） 岁,术前未经任何放化疗.通过免疫组织化学法检测110例原发性胃癌组织及80例癌旁正常胃黏膜组织中JMJD2C和HIF-1α蛋白表达情况.结果 JMJD2C约在69.1%（76例）的胃癌组织中呈高表达,正常胃黏膜组织中表达阴性（P〈0.05）;胃癌组HIF-1α的阳性表达率为73.6%（81/110）,而正常胃黏膜组织中无表达（P〈0.05）.胃癌组织中JMJD2C的表达与肿瘤的分化程度、浸润深度、临床TNM分期和淋巴结转移、远处转移密切均相关（均P〈0.05）,而与患者性别、年龄、肿瘤大小等因素均无关（均P＞0.05）.HIF-1α的表达与胃癌的TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移等均有关（均P〈0.05）,而与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度等因素均无关（均P＞0.05）.JMJD2C和HIF-1α表达呈正相关（r=0.219,P〈0.05）.Kaplan-Meier生存分析显示JMJD2C阳性组和HIF-1α阳性组平均生存时间均分别低于其阴性组[（38±4）比（56±6）个月,（38±4）比（60±6）个月,χ2=8.006、7.218,均P〈0.01];JMJD2C和HIF-1α双阳性组平均生存时间显著低于单阳性组和双阴性组（χ2=10.425,P〈0.01）.结论 JMJD2C和HIF-1α在胃癌组织中呈高表达,二者的表达呈正相关;JMJD2C和HIF-1α共同参与胃癌的发生,浸润,转移等生物学行为,可作为评价胃癌恶性程度和预后分析的新指标.

视网膜母细胞瘤血管生成拟态与临床病理学特征关系的研究

目的探讨视网膜母细胞瘤（Rb）标本中是否存在血管生成拟态（VM），并分析VM与Rb临床病理特征及其与缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达的关系，进一步阐述VM的临床意义。方法实验研究。收集60例Rb患者、10例正常人视网膜组织石蜡标本及相关临床病理资料，应用过碘酸-雪夫（PAS）与CD34双重染色以及免疫组织化学染色法检测60例Rb中是否存在VM和分布，观察与临床病理学特征的关系特点；检测HIF-1α、VEGF蛋白表达，分析Rb瘤组织中VM与HIF-1α、VEGF表达的关系；用CD34抗体进行肿瘤血管内皮染色，并计数肿瘤微血管密度（MVD）。Rb和正常视网膜组织中的VM、HIF-1α、VEGF蛋白阳性表达的比较采用X^2检验；VM阳性组和VM阴性组的MVD值的比较采用q检验。结果HE染色法观察到Rb中存在VM，其为Rb细胞构成的管腔样结构，无内皮细胞衬覆，腔内可见红细胞。CD34和PAS双重染色结合CD34、神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫组织化学染色进一步证明Rb中存在VM，60例Rb中VM阳性率为18．33％（11／60），其中随着R-E分级的增高，VM阳性表达率明显增加，差别具有统计学意义（X^2=8．861，P〈0．05）；分化型Rb中VM阳性率（4．34％）低于未分化型中VM阳性率（22．02％）（X^2=4．872，P〈0．05）；此外，HIF-1α、VEGF在Rb的VM形成过程中的阳性表达率依次为VM阳性组大于VM阴性组大于正常组；微血管密度计数高低与VM的表达有关，VM阴性组的MVD值（49．77±2．05）高于VM阳性组MVD值（36．53±1．15）。结论Rb中存在VM，且肿瘤恶性程度越高，形成VM能力越强。存在VM的Rb组织HIF-1α、VEGF高表达，提示HIF-1α、VEGF在VM的形成中可能起促进作用。

缺氧诱导因子1α表达对裸鼠肝癌皮下移植瘤生长的促进作用

目的探讨缺氧诱导因子1α表达对肝癌移植瘤生长的影响。方法建立强力霉素诱导缺氧诱导因子1α表达的裸鼠肝癌HepG2^Tet-on-HIF-1α细胞皮下移植瘤模型；荷瘤裸鼠口服强力霉素（Dox）后，观察上调缺氧诱导因子1α对皮下移植瘤生长的影响。结果荷瘤裸鼠口服强力霉素可以上调裸鼠皮下移植瘤中缺氧诱导因子1α mRNA和蛋白表达水平；肿瘤体积Dox（＋）组vs．Dox（-）组为（513．545±276．229）mm^3 vs．（166．506±110．142）mm^3（P〈0．05），肿瘤重量（1．251±0．438）g vs．（0．640±0．296）g（P〈0．05），肿瘤生长速度Dox（＋）组明显超过Dox（-）组，肿瘤内面积坏死率明显小于Dox（-）组（31．360％±2．728％）vs．（36．640±3．804％）（P〈0．05）；同Dox（-）组相比，Dox（＋）组裸鼠体重下降更为明显（P〈0．01）。两组荷瘤鼠均无肝、肺转移发生。结论强力霉素可以诱导裸鼠肝癌HepG2^Tet-on-HIF-1α细胞皮下移植瘤模型中缺氧诱导因子1α的表达，促进肿瘤的生长。

HIV-1慢性感染者CD8＋T淋巴细胞CD127表达与CD8＋T淋巴细胞凋亡的关系

目的 研究HIV-1慢性感染者CD8＋T淋巴细胞表面CD127（白细胞介素-7受体α链,IL-7Rα）分子的表达及临床意义.方法 收集24例HIV-1慢性感染者和12名健康人群的外周血,分离外周血单核细胞（PBMC）,用直接免疫荧光染色法标记并用流式细胞仪检测T淋巴细胞表面CD127表达和CD8＋T淋巴细胞的自发凋亡,并对CD8＋T淋巴细胞CD127的表达与CD4＋T淋巴细胞计数、HIV RNA载量以及CD8＋T淋巴细胞自发凋亡作相关性分析.组间比较采用Mann-Whitney U检验,Spearman评价组间相关性.结果 与健康对照组比较,HIV-1慢性感染组中CD8＋T淋巴细胞CD127的表达显著下降,差异具有统计学意义（Z=-4.796,P＜0.01）.CD8＋T淋巴细胞CD127的表达与患者CD4＋T淋巴细胞计数呈显著正相关（r=0.817,P＜0.01）,与血浆HIV RNA载量和CD8＋T淋巴细胞的自发凋亡呈显著负相关（r=-0.442和-0.688,P＜0.05和＜0.01）.结论 HIV-1慢性感染组CD8＋T淋巴细胞CD127表达进行性下降可能是导致细胞接受存活信号能力降低和发生凋亡的重要原因,提示IL-7可能是治疗HIV感染的新途径.

HIV感染患者外周血T淋巴细胞CD127表达的研究进展

白细胞介素7受体（IL-7R）是由α链及γ链构成的,γ链受体广泛表达于淋巴细胞,是IL-2、IL-4、IL-9、IL-15和IL-21的通用受体,可以与这些细胞因子结合并相互作用.CD127是IL-7Rα链,在T淋巴细胞发育过程中,胸腺细胞的分化依赖于IL-7的表达.IL-7可以通过CD127刺激外周非同种异基因反应性T淋巴细胞的增殖,并通过抗凋亡作用促进T淋巴细胞的存活与重构,维持T淋巴细胞内环境稳态[1].

贝伐单抗联合SN-38抑制结肠癌细胞增殖的机制

目的探讨贝伐单抗联合伊立替康（CPT-11）的活性代谢产物SN-38对结肠癌细胞增殖的抑制作用及其机制。方法在缺氧条件下，将贝伐单抗和sN-38作用于人结肠腺癌细胞LoVo，应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法，检测药物对细胞增殖的抑制作用。分别采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot和酶联免疫吸附试验（ELISA），分析药物作用后缺氧诱导因子1α（HIF-1α）及血管内皮生长因子（VEGF）在基因和蛋白表达水平的变化；通过药物对丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰三磷酸肌醇-丝苏氨酸蛋白激酶（P13K-AKT）通路的影响，分析贝伐单抗和sN-38的联合作用机制。结果贝伐单抗联合sN-38序贯给药方案较同时给药对细胞增殖的抑制更强，且以先sN-38后贝伐单抗的给药顺序作用最强，IC50值为（0．057±0．009）μmol／L，较相反给药顺序强3．8倍，较同时给药强8．9倍。HIF—1α的表达水平随着缺氧时间的延长而升高，贝伐单抗和sN-38同时作用可显著抑制其表达；VEGF的表达也随着缺氧时间的增加逐渐增加，SN-38作用12h以上可使VEGF表达下降59．4％，200μg/ml的贝伐单抗作用8h几乎可完全抑制VEGF表达，此时加入SN-38仍可使VEGF表达进一步降低。MAPK通路的p-ERK表达随缺氧时间的增加而升高，sN-38和贝伐单抗同时作用可使p-ERK的表达完全阻断，这与两药对HIF-1α的抑制是一致的。ERK的选择性抑制剂PD98059能够增强贝伐单抗对p-ERK的抑制，同时也增加了贝伐单抗对HIF-1α的抑制。p-AKT的表达虽然随着缺氧时间的延长有所升高，但贝伐单抗和sN-38对其影响并不显著。结论VEGF靶向药物联合化疗药物对细胞增殖的抑制是方案依赖性的，贝伐单抗和sN-38通过对HIF-1α和MAPK通路的调控发挥协同作用。