蛋白质工程提升糖酶热稳定性研究进展

糖酶是制糖工业中不可或缺的一种酶制剂。天然糖酶在长时间高温转化制糖时难以保持较好的稳定性,制约了其在工业生产中的应用。大量研究表明蛋白质工程手段是提升糖酶热稳定性的重要手段和策略。本文系统地综述利用蛋白质工程手段提高糖酶热稳定性的最新进展,详尽分析蛋白质工程中的定向进化、理性设计和半理性设计策略。同时评估这些策略在提高糖酶热稳定性方面的效果及其潜在的工业应用价值,并指出各策略的优势、不足和面临的挑战。最后提出应结合多种方法策略提高糖酶热稳定性的建议,并展望未来研究的方向,以期实现糖酶热稳定性和酶活性的协同提高。

源于细菌Dyella caseinilytica的新型N-糖酰胺酶的特性及其功能分析

N-糖酰胺酶(N-glycosidase,PNGase)是一种糖苷水解酶,主要功能为释放糖肽或糖蛋白上的N-糖链,在食品、生物医药等领域中具有重要的应用价值。目前,商业化的PNGase在使用过程中具有一定的局限性,因此,开发性能优良的新型PNGase具有研究意义。该研究在细菌Dyella caseinilytica中利用编码PNGase的基因,通过在大肠杆菌中进行重组表达,成功获得一种新型PNGase,命名为PNGase Dc,该酶分子质量为63.01 kDa。之后对其酶学特性、功能和应用潜力进行分析。酶学特性结果表明,PNGase Dc的最适pH和温度分别为2.0和37℃,酶促反应无金属离子依赖性;此外,该酶稳定性优良,在4℃下保存45 d仍能维持最高活性;分子对接结果表明,PNGase Dc与底物N′N-二乙酰壳二糖的相互作用力以氢键和范德华力为主;定点突变证明,Asp102和Glu236是影响重组PNGase Dc活性的关键氨基酸;PNGase Dc对标准糖蛋白辣根过氧化物酶和牛乳铁蛋白均具有良好的去糖基化效果;最后,以拟南芥和小鼠血浆作为底物评估PNGase Dc应用潜力,证实PNGase Dc在动植物源糖蛋白的研究中具有一定的应用潜力。综上所述,该研究为动植物源糖蛋白的研究提供了一个新的工具酶PNGase Dc,并为该酶的开发利用奠定理论基础。

不同提取方法对沙棘叶茶活性成分含量、抗氧化能力及α-糖苷酶抑制活性的影响

该文分别以水和60%乙醇为提取溶剂,在55、75℃和95℃下对沙棘叶茶整叶和沙棘叶茶粉进行提取,比较提取物中总黄酮、可溶性总多酚、异鼠李素含量及抗氧化能力和α-糖苷酶抑制能力。结果表明,提取溶剂为60%乙醇、提取温度为95℃时,沙棘叶茶粉提取物中的活性成分含量最高,总黄酮、可溶性总多酚、异鼠李素含量分别为(82.59±1.80)、(117.02±1.93)、(1.592±0.074)mg/g,清除DPPH自由基、羟基自由基和亚硝酸根的能力最强,其EC_(50)值分别为(0.1419±0.0006)、(0.3571±0.0048)、(0.8156±0.0013)mg/g,还原力最高为(118.65±2.40)mg/g,α-糖苷酶抑制能力最强,IC50值为(0.3930±0.0101)mg/g。通过主成分分析,该提取物的样品评分最高。

麻疯树核糖体失活蛋白Curcin和Curcin C的RNA N-糖苷酶活性研究

为探究麻疯树核糖体失活蛋白的RNA N-糖苷酶活性,本研究建立了UPLC-MS/MS方法测定麻疯树核糖体失活蛋白Curcin、Curcin C的体外RNA N-糖苷酶脱嘌呤活性.通过单因素实验得到Curcin与RNA32脱嘌呤反应时,反应的最适条件为37℃、pH=4.2、反应时间为4 h.当Curcin C与RNA32脱嘌呤反应时,反应的最适条件为37℃、pH=3.7、反应时间为8 h.Curcin的K_(m)值为8.231μmol/L,Curcin C的K_(m)值为3.302μmol/L,说明Curcin C与底物的亲和力更大.部分金属离子对CurcinC的酶活性具有促进作用,而对Curcin而言均产生了抑制.腺苷浓度达到250μmol/L时,Curcin C酶活性升高,而对于Curcin没有影响.当酶促反应底物为RNA14和RNA32时,Curcin C蛋白的RNA N-糖苷酶活性都显著高于Curcin,表明Curcin C相较于Curcin更具有抗肿瘤药物开发潜力.

海藻酸钠类糖苷酶活性及其催化机理研究

本研究发现海藻酸钠(SA)具有类糖苷酶活性,并通过4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)和4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷(MUG)两种不同的糖苷酶底物验证了这一发现,同时对SA进行了催化动力学分析;再以重氧水(H_(2)^(18)O)代替普通水(H_(2)^(16)O),利用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)对PNPG的水解产物进行分析。结果表明,SA具有类糖苷酶活性,并且与天然糖苷酶的催化机制类似,即一对羧基分别充当质子供体和亲核试剂,来活化水分子或进攻异头碳,从而断裂糖苷键。

葡萄酒酿造乳酸菌的分离鉴定及糖苷酶活分析

从自然发酵葡萄酒中分离出1株乳酸菌,通过形态观察和分子生物学鉴定,评价乳酸菌的α-L-阿拉伯糖苷酶活、α-L-鼠李糖苷酶活性和β-D-葡萄糖苷酶活性。结果显示,分离菌株为短乳杆菌,其具有α-L-阿拉伯糖苷酶活性、α-L-鼠李糖苷酶活性和β-D-葡萄糖苷酶活性,且在生长平台期酶活较高,主要存在于菌株胞内和完整的细胞中。不同碳源对菌株的上述3种酶活的影响也不同,与葡萄糖为碳源相比,纤维二糖、熊果苷对菌株β-D-葡萄糖苷酶活有一定的促进作用,而对α-L-阿拉伯糖苷酶活有一定的抑制作用;熊果苷对菌株α-L-鼠李糖苷酶活有促进作用,而纤维二糖对菌株α-L-鼠李糖苷酶活有抑制作用。本研究结果为开发新的葡萄酒酿造乳酸菌株及提高葡萄酒品质提供了理论参考。

红江橙果皮黄酮提取物对α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制作用

为进一步高值化利用红江橙(Citrus sinensis Osbeck cv.Hongjiang)果皮,该研究以黄酮提取量作为评价指标,采用超声辅助溶剂提取法和正交试验设计优化黄酮的提取工艺,并探讨黄酮提取物对α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制作用。结果显示,红江橙果皮黄酮类化合物的最佳提取工艺条件:提取温度为70℃、提取料液比为1:5、提取时间为50 min,该条件下黄酮提取量为82.57 mg/g,高于传统乙醇浸提法(23.56 mg/g)。红江橙果皮黄酮提取物(Citrus Sinensis Peel Flavonoids Extract,CSFE)对α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的半抑制浓度IC50值分别为2.95 mg/mL和28.54 mg/mL;在10~50 mg/mL质量浓度范围内,CSFE对胰脂肪酶的抑制活性均呈现明显的质量浓度依赖性;其作用类型均均为混合型抑制。研究表明,红江橙果皮黄酮类提取物具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性和胰脂肪酶抑制活性,可为其在降血糖和减肥功能活性的深入研究提供依据。

复方氨基酸胶囊(8-11)联合左旋肉毒碱治疗弱精子症的临床研究

目的:观察联合应用复方氨基酸胶囊(8-11)和左旋肉毒碱类药物治疗特发性弱精子症的临床效果,并探讨其可能的治疗机理。方法:对多中心符合弱精子症诊断标准的120例特发性弱精子症病例,按照双盲、对照的原则随机分为:复方氨基酸胶囊(8-11)+左卡尼汀口服液作为治疗组;对照组单用左卡尼汀口服液;空白组为给予生活干预者,以上分组治疗疗程均为12周。收集治疗前后各组的精液标本。观察治疗前后精子活动率、中性α-葡糖苷酶含量、精子DNA碎片指数、ROS含量及Nrf2表达量。结果:复方氨基酸胶囊(8-11)与左旋肉毒碱对弱精子症患者精子活力有明显改善作用,治疗后治疗组附睾中性α-葡糖苷酶含量明显增加,ROS含量明显下降,Nrf2表达量明显增加。结论:复方氨基酸胶囊(8-11)联合左旋肉毒碱对弱精子症患者有较好的临床疗效,并未见不良反应。复方氨基酸胶囊(8-11)联合左旋肉毒碱对弱精子症患者的治疗机制可能是:通过调控精子Nrf2通道蛋白的高表达,降低ROS的产生,减轻氧化应激对精子活力的损伤。

953例口服降糖药不良反应/事件报告分析

目的探讨口服降糖药品不良反应/事件(ADR/ADE)发生的一般规律和特点,为临床合理用药提供依据。方法采用回顾性研究方法,收集2012年1月1日至2022年12月31日武汉市ADR/ADE自发呈报系统数据库中10种口服降糖药ADR/ADE报告,采用描述性方法对报告信息、患者人口学特征、用药情况和累及系统-器官分布及临床表现等进行分析。结果共纳入口服降糖药ADR/ADE报告953例,涉及1405例次,数量呈逐年上升趋势,程度以“一般”为主(88.67%),“严重”占11.33%;以胃肠系统损害、皮肤及其附件损害和代谢与营养障碍最为多见,频次排序前3位的药物类别为α-糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类和双胍联合噻唑烷二酮复方制剂。不同类别药物所致ADR/ADE的累及系统-器官和临床表现各具特点,钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂以尿路损害和生殖器瘙痒为主,二肽基肽酶Ⅳ抑制剂以皮肤及皮肤附件疾病损害为主,格列奈类所致低血糖居多,其他类别最常见胃肠道不适,基本与药品说明书相符。结论口服降糖药的ADR/ADE涉及系统广泛,且呈逐年增多趋势,特别需关注新型口服降糖药,通过多方位药学服务,提升患者自我管理能力,加强ADR/ADE风险防范意识,及时识别并处理ADR/ADE,保障患者用药安全。

不同干燥方式对马蓝叶的β-葡萄糖苷酶活性和药效成分的影响

以贵州马蓝叶为研究对象,探究阴干、晒干、真空干燥、50℃烘干、100℃烘干、冷冻干燥、热风枪吹干、微波干燥和微波烘干9种干燥方式对马蓝叶叶片性状、药效成分和β-葡萄糖苷酶活性的影响。结果表明:微波干燥和微波烘干方式处理的干叶仍保留绿色舒展状态,色泽均匀,外观品相较好;50℃烘干的马蓝干叶含有较高质量分数的靛蓝和靛玉红,分别为0.68%和0.051%,并且叶片中β-葡萄糖苷酶具有较高活性(12.23 U/mg);微波干燥的马蓝叶具有外观较好、吲哚苷成分较高(8.84%)的优点,但是叶片中的β-葡萄糖苷酶几乎完全失活。

患白内障病黑斑蛙米尔伊丽莎白菌的分离鉴定与PNGase基因克隆

为给安徽舒城地区患白内障病黑斑蛙(Pelophylax nigromaculatus)提供治疗方案,对病蛙进行了细菌分离、鉴定和药敏检测。从典型患病黑斑蛙的肝脏、眼睛、脑和脊柱中分离出4株优势菌株,经16S rRNA和gyrB基因序列分析,结合生理生化鉴定,结果表明,4株菌株均为米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)。对分离菌的N-糖苷酶(PNGase)基因进行了克隆和分析,结果显示,其包含PNGase F和PNGase F-Ⅱ两种类型,进化分析结果同样显示,其与米尔伊丽莎白菌聚为一支,表明PNGase基因序列可作为伊丽莎白菌属内部菌分类的参考依据。药敏试验结果显示,4株分离株仅对酰胺醇类中的氟苯尼考敏感,对香豆素类中的新生霉素、大环内酯类中的红霉素和利福霉素类中的利福平等3种抗生素中介,而对测试的其他14种抗生素耐药。实验结果为伊丽莎白菌属细菌的分类鉴定提供了参考方法,且为黑斑蛙细菌病防治提供参考依据。

结肠肠气囊肿症患者的临床特征分析(附33例报告)

目的浅析结肠肠气囊肿症(PCI)可能的病因、临床和内镜下特点,以及合适的治疗方法。方法回顾性分析2017年5月-2022年3月该院消化内科确诊为PCI的33例患者的临床资料。结果纳入的33例PCI患者中,男20例,女13例,年龄(56.58±11.69)岁;该病检出率为0.11%(33/30833)。33例患者中,无症状者占30.30%(10/33),主要临床症状为:腹痛12例(36.36%),腹胀12例(36.36%),腹泻10例(30.30%),便秘5例(15.16%),便血5例(15.16%),体重减轻1例(3.03%),癌胚抗原(CEA)升高2例(6.06%)。21例单发气囊肿,12例多发气囊肿,两组年龄、性别、原发病、肠镜下合并其他内镜诊断、临床症状、气囊肿直径和肠段部位分布比较,差异均无统计学意义(P>0.05);而病变表面情况(光滑、红斑、糜烂)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PCI较罕见,临床表现不典型,内镜下微创治疗是有效的措施,多数患者预后良好。

乳酸菌XHR-2的发酵特性及糖苷酶活性分析

以夏黑葡萄自然发酵中分离的乳酸菌XHR-2为研究对象,对其发酵特性和糖苷酶活性进行研究。结果表明,乳酸菌XHR-2在模拟葡萄酒培养基中发酵192 h可使L-苹果酸降解完全,该菌株可耐受14%vol酒精度、60 mg/L SO2、pH值3.6和温度16℃。乳酸菌XHR-2具有β-D-葡萄糖苷酶活和α-L-阿拉伯糖苷酶活,其细胞破碎液、完整细胞的β-D-葡萄糖苷酶活分别为8.31μmol/(g·min)、4.52μmol/(g·min),α-L-阿拉伯糖苷酶活分别为3.30μmol/(g·min)、3.01μmol/(g·min)。

α糖苷酶抑制剂联合磷酸西格列汀治疗2型糖尿病患者的临床疗效及不良反应

目的探讨2型糖尿病患者α糖苷酶抑制剂联合磷酸西格列汀治疗的临床疗效及不良反应。方法选取2022年1—12月本院收治的2型糖尿病患者300例为研究对象,依据用药方法分为α糖苷酶抑制剂联合磷酸西格列汀治疗组(联合用药组)、单独磷酸西格列汀治疗组(单独用药组)两组,每组样本为150例,治疗后对两组患者体质量指数、CRP、血糖水平、治疗有效率和不良反应发生率进行分析。结果用药前,两组患者的体质量指数、CRP、血糖水平之间的差异均显著(P>0.05);用药后,两组患者的体质量指数、CRP水平、血糖水平均低于用药前(P<0.05)。联合用药组患者的体质量指数低于单独用药组(P<0.05),CRP水平低于单独用药组(P<0.05),血糖水平低于单独用药组(P<0.05)。联合用药组总有效率高于单独用药组(P<0.05)。联合用药组不良反应发生率低于单独用药组(P<0.05)。结论2型糖尿病患者α糖苷酶抑制剂联合磷酸西格列汀治疗的临床疗效较显著,且不良反应较少。

五种中药对两种不同来源α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用比较

目的:比较大鼠小肠黏膜α-葡萄糖苷酶提取液和市售α-葡萄糖苷酶建立的α-葡萄糖苷酶抑制剂微量筛选模型;筛选对α-葡萄糖苷酶抑制作用较强的中药。方法:采用葡萄糖氧化酶法比较两种来源的α-葡萄糖苷酶活性,确立最优反应条件,并对五倍子等五种中药水煎液的α-葡萄糖苷酶抑制作用进行比较。结果:五种中药对两种不同来源的α-葡萄糖苷酶均有抑制作用,其中五倍子的作用最强。结论:一定浓度下,两种不同来源α-葡萄糖苷酶活性有一定差异,但对体外筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂研究结果无显著的影响。

麻疯树核糖体失活蛋白的分离纯化和作用机制研究

从麻疯树种子中分离纯化出一种核糖体失活蛋白 ,用SDS PAGE测定其相对分子量为 2 8 2kD ,IEF PAGE计算其等点电为 8 5 4左右。体外抑制实验表明 ,麻疯树核糖体失活蛋白对兔网织红细胞裂解液的蛋白质生物合成有较强的抑制活性。当麻疯树核糖体失活蛋白作用于大鼠肝核糖体经苯胺处理后 ,在聚丙烯酰胺的尿素变性胶电泳图上能观察到 4 5 0bp左右的特征性核酸条带 ,证明麻疯树核糖体失活蛋白是一种RNAN 糖苷酶 ,从而首次阐明了麻疯树核糖体失活蛋白失活核糖体的分子机制。

茶树挥发性萜类物质及其糖苷化合物生物合成的研究进展

挥发性单萜(C10)与倍半萜(C15),常具有宜人的花果香气。茶鲜叶中此类物质的种类及其糖苷化合物的含量和水解对成品茶的香气香型有重要影响。就可能影响茶树挥发性萜类物质及其糖苷化合物合成途径中的限速反应和相关的酶进行综述,认为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是影响萜类代谢前体异戊烯基焦磷酸(IPP)及二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)的限速酶。单萜和倍半萜合成酶是挥发性萜类化合物生物合成途径中的关键酶。此外,糖基转移酶可能与茶鲜叶中糖苷态萜类香气化合物的合成和积累有关。糖苷水解酶则催化茶鲜叶中糖苷态香气物质的水解,导致香气物质的释放。调节相关基因的表达,将有可能控制萜类代谢流向挥发性萜类合成分支。本文还讨论了影响茶叶香气品质的其他因素,如茶树品种、栽培环境,以及加工方法等。

葡萄汁有孢汉逊酵母糖苷酶增香酿造葡萄酒的潜力分析

评价了优选葡萄汁有孢汉逊酵母分泌的糖苷酶用于干红葡萄酒的增香酿造效果。实验以陕西杨凌黑比诺葡萄为原料,采用优选菌株糖苷粗酶进行发酵前处理,酿造干红葡萄酒,并以AR2000酶处理为比照,实验中糖苷酶的酿造环境耐受性分析以β-葡萄糖苷酶的酶活表示。葡萄酒香气成分采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用仪(SPME-GC-MS)检测,香气特征采用感官量化品评法分析。结果表明,优选菌株糖苷酶更多地水解葡萄中去甲类异戊二烯和一些萜烯类的糖苷,催化水解C6化合物前体较少,所酿酒表现出温带水果、小浆果和花香特征;而AR2000酶在大量水解萜烯类香气糖苷的同时,水解大量C6化合物前体,导致所酿酒生青味突出。因此,优选菌株糖苷酶有良好的增香酿造潜力。

59份野生桑桑叶中的DNJ含量及粗提物对α-糖苷酶的抑制活性

对来自云南省不同地区的59份野生桑桑叶中的1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量,以及桑叶粗提物对淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶的体外抑制活性进行了测定,同时采用液-质联用(LC-MS)仪分离纯化桑叶粗提物中的DNJ,并对其抑制蔗糖酶的机制进行了初步研究,期望筛选出适用于治疗糖尿病药物开发的药用桑资源,以及为解析桑叶粗提物和纯化的桑叶DNJ抑制α-糖苷酶活性的机制提供线索。研究结果表明:不同来源的野生桑桑叶中的DNJ含量存在明显差异,其中来自开远地区的岩桑桑叶中DNJ的质量分数高达0.791 1%,是具有药用开发价值的野生桑资源;不同来源的野生桑桑叶粗提物对淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶活力的体外抑制率差异显著,但抑制活性的大小与样品中的DNJ含量不成正比,推测桑叶中除含有DNJ外还含有具有明显的α-糖苷酶抑制活性的多种DNJ类似物;从野生桑桑叶粗提物中分离纯化的DNJ对淀粉酶无明显抑制活性,但对蔗糖酶和麦芽糖酶有显著的抑制活性,对蔗糖酶表现为非竞争性抑制作用。

糖苷水解酶在糖苷合成中的应用概况

糖苷是一类附加值很高的生理活性化合物;应用糖苷水解酶催化合成这类化合物具有很好的应用前景.综述了糖苷水解酶在催化寡糖、脂肪醇或芳香醇、多肽、萜类、酚类、生物碱以及抗生素等底物糖基化中的研究进展,着重说明了糖苷水解酶应用于合成反应的两种反应模式,即逆水解反应和转糖苷反应.另外还介绍了用于糖苷酶催化生产糖苷化合物的几类生物反应器.