苋菜AmPCS基因的克隆及表达载体构建

合成植物络合素(PCs)是高等植物减轻重金属毒害的重要机制。通过对镉超积累苋菜品种天星米植物络合素合成酶基因(PCS)的克隆及表达载体构建,旨在为植物修复镉污染土壤奠定基础。依据同源克隆原理,通过RT-PCR和RACE方法克隆苋菜PCS基因。序列分析表明:苋菜PCS基因cDNA全长1 770 bp,包含完整的阅读框,编码485个氨基酸;苋菜PCs合成酶与拟南芥、遏蓝菜、芥菜及油菜PCs合成酶相似性为91.96%～95.67%,其氨基酸序列N端有1个Pfam:Phytochelatin结构域(功能为催化合成植物络合素)、C端有1个Pfam:Phytochelatin_C结构域(功能为重金属离子感应器)。因此,推断苋菜PCS基因编码蛋白是PCS-like家族的新成员,具有催化合成植物络合素的功能,将它在GenBank注册,序列号为:JN979370,命名为AmPCS。在AmPCS基因的编码区加入BamH I和Sac I酶切位点,双酶切植物表达载体pBI-121和带有酶切位点的PCR产物,成功获得苋菜PCS基因正义表达载体pBI-PCS。

质粒AmpCs检测方法的研究

目的 :探讨质粒介导的 型β-内酰胺酶 (Am p Cs)的检测方法。方法 :用直接法、间接 法和间接 法 ,对 385株细菌进行了质粒 Am p Cs检测 ,并对结果进行了比较。结果 :共检出阳性菌 17株 ,可疑菌 8株 ,直接法检出率最低 ,间接 法和间接 法的检出率相同 ,在部分可疑结果的判断上 ,间接 法不如间接 法。结论 :间接 法操作方便 ,可避免一些不良因素的影响 ,准确性和特异性高 ,在临床上值得应用。

用头孢西丁三相试验检测质粒AmpCs

为了解大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产质粒介导的 型β-内酰胺酶 (Am p C)的情况 ,利用头孢西丁三相试验的直接法和间接法 ,对 5 5株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌进行检测 ,结果有 2株阳性 。

头孢西丁三相试验检测质粒AmpCs三种方法的比较

质粒介导的AmpC酶,系基因转移至质粒使之成为质粒AmpC酶,这种新的耐药表型因其较快的传播速度和较强的耐药性,开始引起人们的关注。而在临床常规药敏中发现,质粒AmpCs对β-内酰胺类药物的表型有时并不一定耐药。

一株多重耐药大肠杆菌全基因组测序及其耐药性分析

为了解大肠杆菌携带的粘菌素耐药基因并筛选敏感药物,解决多重耐药和动物临床无药可选的困局,采用16S rRNA菌种全基因组测序,PCR筛查mcr-4、mcr-5、blaTEM和AmpC酶耐药基因,应用BLAST和MEGA软件进行生物信息学和系统进化树分析,并对该菌株进行了78种抗生素抗菌药物敏感性测试及4种天然植物提取物(黄藤素、黄连素、黄芩苷和博落回)的抑菌、杀菌效果试验。结果表明,从2021年(1—12月)和2022年(1—6月)猪临床腹泻病例肠道中分离鉴定的145株大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)中,鉴定出1株同时携带粘菌素耐药基因(mcr-4,mcr-5)和β内酰胺酶blaTEM、AmpC基因的猪源大肠埃希氏菌临床菌株HN2149。78种抗生素药敏试验结果显示,HN2149菌株对头孢吡肟、头孢地嗪、磷霉素、头孢克肟、头孢唑林、头孢哌酮、美洛培南、头孢西丁、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢噻肟/克拉维酸、头孢唑肟、头孢美唑、头孢他啶/克拉维酸和头孢他美敏感,对其余57种抗菌药物表现为耐药。4种植物提取物的药敏结果显示,博落回对菌株HN2149的抑菌、杀菌效果较好,其余3种提取物均对该菌株无抑菌和杀菌效果。以上研究结果为猪大肠杆菌病的防控提供参考。

常见革兰阴性杆菌AmpC酶的检测分析

目的了解常见革兰阴性杆菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞AmpCs发生率及表型构成,以及产ESBLs的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌AmpC酶的发生率及表型构成。方法采用底物协同-拮抗法(MSSAT)检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌产AmpCs情况及表型构成。结果产ESBLs的大肠埃希菌和产ESBLs的肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌AmpC酶检出率分别40%、56%、100%、100%、100%。结论产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌同时存在AmpC酶的机制,应引起临床和实验室工作者的重视。AmpC酶的耐药表型与菌株的耐药程度相关。

多黏菌素B和米诺环素对鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性检验研究

目的 探究多黏菌素B和米诺环素对鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性。方法 择取2021年1月至2023年1月本院80例鲍曼不动杆菌感染患者深入分析,均采用多黏菌素B、米诺环素检验鲍曼不动杆菌,分析体外抗菌活性。结果 鲍曼不动杆菌产酶类型有产金属β内酰胺酶(MBLs)、质粒型AmpC酶、诱导型AmpC酶。鲍曼不动杆菌产MBLs阳性例数为75例,阳性率为93.75%;产质粒型AmpC酶阳性例数为35例,阳性率为43.75%;产诱导型AmpC酶阳性例数为30例,阳性率为37.50%。多黏菌素B产MBLs型、产质粒型AmpC型、产诱导型AmpC酶鲍曼不动杆菌最低抑菌浓度(MIC)范围、MIC50、MIC90低于米诺环素,抑菌率较米诺环素高(P<0.05)。结论 在对鲍曼不动杆菌检测时,多黏菌素B与米诺环素相比,米诺环素活性更强。

Phenotypic Characterization of Extended Spectrum Beta-Lactamase, Class C Cephalosporinase and Carbapenemase-Producing Klebsiella Species Isolated from Patients Consulted at Four Yaounde-Based Hospitals

Background: Klebsiella spp. are bacteria of medical importance for their role in opportunistic infections which are often difficult to treat because of resistance to one or several antimicrobials. The aim of this study was to determine antimicrobial resistance due to Extended Spectrum Beta-lactamase (ESBL), Class C cephalosporinase (AmpC) and carbapenemase enzymes in Klebsiella spp. isolated from patients consulted at four hospitals. Methodology: The study was cross-sectional and descriptive. A total of 4190 non-repetitive patients specimens from 13 types of clinical specimens were analysed from February to November 2020. Two hundred and twenty-five (225) Klebsiella spp isolates were identified using API 20E and antimicrobial susceptibility testing done according to the Kirby Bauer disc diffusion method. ESBL and AmpC phenotypes were determined by the combination disc method and carbapenemases by double disc synergy method, referenced by EUCAST guidelines for the resistance testing. Results: The frequency of the species was Klebsiella pneumoniae (69%, 155/255), K. oxytoca (14%, 31/255), K. ozaenae (12%, 27/225) and K. rhinoscleromatis (5%, 11/225). Isolates were most resistant to sulphomethoxazole trimethoprim (84%, 189/225), cepaholosporins (80%, 180/225), and least resistant to carbapenems (10.7%, 24/225). Two K. oxytoca and one K. pneumoniae were resistant to all antibiotics tested. Klebsiella pneumoniae had the most multidrug resistant isolates (59.4%, 134/225). Most isolates (83.6%, 188/225) expressed at least one enzyme, while 63.6% (143/225) of the isolates expressed at least two enzymes. Some isolates were ESBL (71.6%, 161/225), carbapenemase (10.7%, 24/225) and AmpC (6.6%, 15/225) producers. Three carbapenemases (Klebsiella pneumoniae carbapenemase-KPC, Metallo-Beta Lactamase-MBL and OXA-48) were detected. Conclusion: These results revealed that resistance of Klebsiella spp. to cephalosporins is high and this may be exacerbated by co-expression of AmpC and carbapenemases aggravating associated patient morbidity and mortality. Monitoring of antimicrobial resistance of local strains is necessary for informed decisions on empirical treatment. .

亚胺培南诱导常见革兰阴性杆菌产生AmpC酶的研究

目的：了解亚胺培南对鲍氏不动杆菌,阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、以及产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等常见革兰阴性杆菌透导性AmpC酶的发生率。方法：采用底物协同—拮抗法(MSSAT)检测大肠埃希菌,肺炎克雷伯菌,铜绿假单胞菌,鲍氏不动杆菌和阴沟肠杆菌产AmpC酶的情况及构成。结果：产ES- gLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍氏不动杆菌AmpCs酶的检出率分别为20．7%,23．1%,76%,75%,87．9%；高诱导型AmpC酶的检出率分别为0,15．4%,44%,35%,9．1%；部分去阻遏型AmpC酶的检出率分别为3．5%,7．7%,16%,30%,15．2%；完全去阻遏型AmpC酶的检出率分别为17．2%,0%,16%,10%,63．6%。结论：亚胺培南对铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌产AmpC酶具有高度诱导性,而对产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌及鲍氏不动杆菌诱导性低,应引起临床和实验室的重视；AmpC酶的诱导表型与菌株的耐药程度相关。

13种抗生素对产AmpC酶或同时产ESBLs细菌的体外抗菌活性

目的 了解临床下呼吸道感染常见革兰氏阴性杆菌产 Amp C酶或同时产超广谱β-内酰胺酶(ESBL s)的情况 ,检测常用 13种抗生素对这些菌株的体外抗菌活性 ,以指导临床合理选择抗生素。方法 采用酶提取物三维试验确证产 Amp C酶或同时产 ESBL s菌株 ,应用琼脂二倍稀释法测定抗生素对这些菌株的最低抑菌浓度 (MICs)。结果 从临床痰标本分离对第一、二代及一种以上第三代头孢菌素耐药的 2 2 6株常见革兰氏阴性杆菌 ,包括阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、鲍氏不动杆菌和铜绿假单胞菌 ,其中单产 Amp C酶 34株 ,同时产 Amp C酶和 ESBL s15株 ,总检出率分别为 15 .0 % (34/ 2 2 6 )、6 .6 %(15 / 2 2 6 )。无论单产 Amp C酶还是同时产 Amp C酶和 ESBL s的细菌对第三代头孢菌素、氨曲南及头孢美唑高度耐药 ,敏感率从 0～ 14 .7% ;对含 β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂哌拉西林 /三唑巴坦、阿莫西林 /克拉维酸、头孢哌酮 /舒巴坦耐药情况亦严重 ,敏感率从 0～ 2 9.4 % ;对环丙沙星、左氧氟沙星除大肠埃希氏菌外有较高的敏感性 ,总敏感率均为 71.4 % ;而对亚胺培南高度敏感 ,仅有 1株铜绿假单胞菌耐药。单产 Amp C酶细菌对头孢吡肟、阿米卡星敏感率分别为 97.1%、6 4 .7% ,同时产 Amp C酶?

动物源大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶与头孢菌素酶基因型分析

为了解重庆地区动物源大肠杆菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及头孢菌素酶(AmpC)基因型的分布,利用初筛及表型确认方法,从临床分离的192株仔猪白痢大肠杆菌、65株奶牛乳腺炎大肠杆菌、69株鸡大肠杆菌中筛选出19株产ESBLs、6株产AmpC酶大肠杆菌,并应用PCR扩增及PCR产物测序方法进行ESBLs及AmpC基因型分析。结果显示,重庆地区动物源大肠杆菌携带TEM型、CTX-M型、DHA-1型和CMY-2型基因的阳性率分别为2.15%、5.21%、0.61%和0.61%。其中,有5株同时携带2种基因。而DHA-1型基因为国内兽医临床首次检出,获得GenBank登录号为FJ386455。结果提示,重庆地区以TEM型和CTX-M型β-内酰胺酶为主,且产ESBLs与AmpC酶大肠杆菌为多重耐药菌株,需引起兽医临床的高度重视。

阴沟肠杆菌质粒型AmpC酶基因的研究

目的调查阴沟肠杆菌质粒型AmpC酶基因的流行状况及基因型。方法采用ATB药敏试验板微量肉汤法,对44株临床分离的阴沟肠杆菌进行抗菌药物敏感试验,PCR方法检测DHA和ACT型AmpC酶基因。结果44株阴沟肠杆菌呈多重耐药;36株质粒AmpC酶基因阳性(81.8%),DHA和ACT-1基因阳性率分别为11.4%、79.5%,而且3株阴沟肠杆菌同时携带DHA和ACT-1基因。结论临床分离的阴沟肠杆菌多重耐药严重、质粒AmpC酶基因携带率高;阴沟肠杆菌中检出ACT-1基因为国内首次报道。

多重耐药阴沟肠杆菌流行状况及耐药机制的研究

目的了解多重耐药阴沟肠杆菌的流行状况及耐药机制。方法58株临床分离的对第三代头孢菌素耐药的阴沟肠杆菌进行琼脂稀释法药敏试验、表型筛选法和聚合酶链反应克隆测序。结果58株阴沟肠杆菌表型筛选结果显示,高产AmpC酶株、单产ESBLs株和同时产AmpC酶和ESBLs株的检出率分别为65.52%、13.79%和20.69%;58株阴沟肠杆菌对多种抗菌药物耐药,高产AmpC酶菌株、单产ESBLs菌株和同时产AmpC酶和ESBLs菌株对头孢哌酮/舒巴坦的敏感率分别为55.3%、87.5%和16.7%;对哌拉西林/他唑巴坦的敏感率分别为28.9%、50%和8.3%;对头孢吡肟的敏感率分别为97.4%、37.5%和16.7%;对亚胺培南的敏感率均为100%;58株临床分离株ESBLs编码基因的测序结果显示,分别为SHV2、SHV2a、SHV12、CTXM14和CTXM3型ESBLs;58株临床分离株的ampD基因PCR扩增显示49株阳性,占84.48%,对其中8株进行克隆测序,均存在可疑的羧基端突变位点。结论产生AmpC酶和ESBLs是阴沟肠杆菌对头孢菌素耐药的主要机制。

产超广谱β-内酰胺酶和质粒介导的AmpC酶肺炎克雷伯菌耐药性及基因型研究

目的 了解我院临床分离的肺炎克雷伯菌耐药性及超广谱β-内酰胺酶和质粒介导的AmpC酶基因型。 方法采用Microscan微生物鉴定仪、微量肉汤稀释法,测定临床分离的肺炎克雷伯菌对21种抗菌药物的敏感 性;采用聚合酶链反应(PCR)及测序技术分析超广谱β-内酰胺酶和质粒介导的AmpC酶基因型。结果 肺炎克 雷伯菌对亚胺培南全部敏感,对环丙沙星、哌拉西林／他唑巴坦、头孢他啶、头孢西丁、头孢哌酮／舒巴坦、阿莫西 林／舒巴坦、阿米卡星、头孢噻肟和头孢哌酮的耐药率分别为36.6％、38.3％、56.7％、63.4％、81.7％、86.7％、 96.6％、98.3％和98.3％,对其他药物的耐药率为100％;60株肺炎克雷伯菌全部扩增出TEM基因,有25株细 菌检出CTX-M-Ⅰ群基因,有54株细菌扩增出DHA基因,而PER和MIR(ACT-1)全部为阴性;且有21株肺炎 克雷伯菌同时携带CTX-M-Ⅰ群、DHA和TEM基因。结论我院临床分离的肺炎克雷伯菌为多重耐药菌,同时 存在CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶和DHA-1型质粒介导的AmpC酶,尚未发现PER型超广谱β-内酰胺酶和 MIR型质粒介导的AmpC酶。

耐头孢西丁革兰阴性杆菌高产AmpC酶发生率及基因型与耐药性研究

目的了解耐头孢西丁革兰阴性杆菌高产AmpC酶发生率及基因型分布和耐药性。方法对155株无重复耐头孢西丁革兰阴性杆菌,用酶提取物三维试验检测AmpC酶;ATB药敏试验板和K-B法检测产酶株的药物敏感性;质粒转化试验定位耐药基因;PCR扩增AmpC酶与ESBLs基因及其序列测定确定其基因型。结果高产AmpC酶的发生率为23.2%;自2株肺炎克雷伯菌和5株大肠埃希菌中检出DHA-1、CMY-2和CMY-22型AmpC酶,5株大肠埃希菌还分别同时携带TEM-1型广谱酶和TEM-144、CTX-M-27和CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶;CMY-22型和TEM-144型β-内酰胺酶是国内外首次报道,获得美国GenBank登录号分别为DQ256079和DQ256080。结论加强耐头孢西丁革兰阴性杆菌高产AmpC酶的监测,治疗相关菌感染以亚胺培南和美罗培南为首选;福州发现DHA-1、CMY-2和CMY-22型AmpC酶。

大肠埃希菌、克雷伯菌中质粒AmpC酶的流行分布

目的了解我院大肠埃希菌、克雷伯菌中质粒AmpC酶的流行分布及其基因型特征。方法对1 935株大肠埃希菌、克雷伯菌进行了AmpC酶纸片扩散法筛选试验(头孢西丁≤18),对筛选阳性株分别进行三维试验、多重聚合酶链反应(PCR)、等电聚焦电泳(IEF)、接合试验、PCR及测序,以确定表型及基因型。结果1 935株细菌中,纸片筛选、三维试验、多重PCR的阳性数分别为327、85、54株;13株产C IT群质粒AmpC酶细菌有4株接合试验阳性;IEF证实这4株细菌均产生等电点为9.0、可以被氯唑西林抑制而不能被克拉维酸抑制的β-内酰胺酶。结论我院大肠埃希菌、克雷伯菌中质粒AmpC酶的阳性率为2.79%(54/1 935)。基因型为DHA群和C IT群2类。

产生ESBLs和AmpC酶的肠杆菌科细菌检测及耐药性分析

目的了解我院产ESBLs和AmpC酶细菌的耐药性。方法对产ESBLs菌和产生AmpC酶菌进行表型的筛选和确证,测定21种药物的耐药性。结果 268株菌中检出ESBLs菌136株,检出率50.75%,AmpC酶菌116株,检出率43.28%。单产AmpC酶菌,单产ESBLs菌及产AmpC和ESBLs的菌对青霉素、第二、三代头孢菌素类药物的耐药率明显高于非产酶菌的耐药率,两者相比有显著性差异(P<0.05),多重耐药及泛耐药常见。结论 ESBLs与Amp酶已成为我院肠杆菌科细菌耐药的主要原因。碳青霉烯类、第四代头孢菌素、哌拉西林/三唑巴坦成为我院治疗院内感染的首选药。

检测AmpC酶三维试验方法的改进

目的简便检测AmpC酶三维试验的方法。方法将提取AmpC酶冻溶的温度-70℃改为-20℃,将加酶的挖槽法改为打孔法。结果55株耐三代头孢菌素和头孢西丁的细菌,用两种冻溶方法均检出6株高产AmpC酶菌,其中用原提酶法,5株菌在挖槽和打孔中加入粗酶液10μl,另1株菌在挖槽和打孔中加入粗酶液30μl时出现阳性结果;用改进提酶法,5株菌在挖槽和打孔中加入粗酶液10μl,另1株菌在打孔中加入粗酶液30μl,而在挖槽中加入50μl时出现阳性结果。结论改进的提取AmpC酶的方法与原方法结果相同,改进的加酶打孔法比挖槽法优越,改进的三维试验方法简便、准确、不需要特殊设备,适合于各级实验室应用。

5种中药对产酶菌的抑菌作用

目的探讨5种中药对产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及持续高产AmpC酶菌株的抑菌作用。方法采用琼脂对倍稀释法分别检测5种中药对产ESBLs和AmpC酶菌株的最低抑菌作用。结果5种中药对产ESBLs和AmpC酶菌株均有不同程度的抑菌作用,其中黄芩抑菌效果较好,对产ESBLs的大肠埃希菌(46/80)的最低抑菌浓度为31.25 mg/m l,产AmpC酶的肺炎克雷伯菌(19/30)其最低抑菌浓度为31.25 mg/m l,其次为黄连和千里光等。结论部分中药对产ESBLs和AmpC酶菌株有不同程度的抑菌作用。

多重耐药阴沟肠杆菌β-内酰胺酶编码基因的研究

目的 了解北京朝阳医院临床分离的多重耐药阴沟肠杆菌的 β-内酰胺酶编码基因。方法 对 12株临床分离的多重耐药的阴沟肠杆菌进行琼脂稀释法药敏试验、改良三维试验法和聚合酶链反应克隆测序。结果 12株阴沟肠杆菌对多种抗生素耐药 ,改良三维试验法证实同时产生 Am p C酶和 ESBL s;其中 ,9株 ESBL s编码基因PCR结果阳性 ,分别为 SHV- 2、SHV- 12、CTX- M- 3和 CTX- M- 14型 ESBL s;对另外 3株进行粗酶等电点测定发现 ,存在 7.89和 8.0等电点条带 ,并被克拉维酸抑制 ;12株细菌 am p D和 amp C基因 PCR扩增均呈阳性 ,将 6株耐药菌进行 amp D基因的克隆测序发现均存在羧基端可疑的突变位点。结论 12株多重耐药的阴沟肠杆菌同时产生≥ 1种的 ESBL s及高产 Am p C酶。