易错PCR定向进化技术提高蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10核酸酶活性的研究

以分子伴侣skp修饰的蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10)全基因为模板,通过易错PCR定向进化技术构建突变体文库,以酵母tRNA为底物建立高通量筛选方法,获得了核酸酶活性提高的AmPR-10突变体。经一轮定向进化后,突变体A4的核酸酶活性比野生型提高45%;测序结果显示,突变体A4基因序列在465位增加了1个碱基A,进而由移码突变引起了多肽序列的提前终止,使得突变体A4 C末端缺失了3个氨基酸;从空间上看,AmPR-10基因的突变减小了其C末端α螺旋对空腔的遮蔽作用,有利于目的蛋白与配体或底物的结合。该研究结果对AmPR-10核酸酶活性机制的探讨具有重要意义,为抗病抗逆黄芪植株的培育奠定了理论基础。

蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10及其突变体的外源表达和活性测定

目的:蒙古黄芪病程相关蛋白(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10,AmPR-10)具有核酸酶活性,对黄芪生长发育的抗病过程有重要作用。为进一步提高野生型AmPR-10的活性,设计了相应突变体,并分析其表达量和活性较野生型的变化。方法:通过理性分析发现野生型AmPR-10的Ser(84)、Gly(140)、Glu(141)突变后会影响目标蛋白的空间结构、降低底物单核苷酸的对接自由能,据此设计合成了两个突变体M1:S84D+G140V、M2:S84D+G140V+E141M,并对野生型AmPR-10与M1、M2分别进行外源低温诱导表达,同时测定了他们的核酸酶活性和抗菌抑菌作用。结果:突变体M1、M2经诱导后表达量和核酸酶活性皆高于野生型,其中M1、M2核酸酶活性分别为野生型的1.46倍及1.45倍;突变体M1可对金黄色葡萄球菌产生抑菌作用,抑菌环大小约为5 mm。结论:AmPR-10突变体的活性较野生型有所提高,这一结果有利于深入探讨AmPR-10的相关活性机制,为抗病黄芪的育种奠定理论依据。

同源蛋白序列比对探讨AmPR-10核酸酶活性机理

蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10)对黄芪生长发育及抗病机制有重要意义。研究检测出以大肠杆菌为宿主外源表达的AmPR-10具有核酸酶活性。将AmPR-10与其同源的7个已证明具有核酸酶活性的蛋白进行氨基酸序列比对,发现AmPR-10基因有4个高保守区段,分别是:14~24位、44~55位、64~70位及83~88位。其中第一段保守区与C-末端的α螺旋在空间上形成较强的疏水区以稳定蛋白空腔的结构,利于AmPR-10在抵御侵害时功能的发挥;另由分子对接和氨基酸单点突变发现第4段保守区的83位Tyr是AmPR-10具有核酸酶活性的关键位点,其突变会影响目标蛋白与底物结合的稳定性,而非保守区域140位Gly可作为基因进化的参考位点,当突变为Asn、Val及Trp时,AmPR-10与底物的结合自由能下降。以上结果对深入理解及优化AmPR-10的核酸酶活性具有理论指导意义。

蒙古黄芪中核糖核酸酶活性蛋白AmPR-10的纯化和性质研究

目的采用全自动智能蛋白纯化系统AKTA Avant25建立蒙古黄芪病程相关蛋白(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10,AmPR-10)的稳定快速分离纯化方法,并分析其理化性质和生物学活性。方法蒙古黄芪经Tris-HCl缓冲液浸提后阴离子交换色谱捕获目标蛋白,疏水色谱精细分离,凝胶滤过色谱进一步精细分离得到AmPR-10。采用MALDI-TOF/TOF质谱法测定相对分子质量,质谱检测后MS/MS Ion Search检索鉴定蛋白,高碘酸-Schiff法判断是否为糖蛋白,琼脂糖凝胶电泳分析核糖核酸酶活性及不同影响因素对核糖核酸酶活性的影响。结果蒙古黄芪粗提液经Q Sepharose Fast Flow、Butyl Sepharose High Performance和SuperdexTM 75 10/300 GL 3步纯化后可得到电泳纯AmPR-10;质谱测定其相对分子质量为16 801;蛋白鉴定其属于PR-10蛋白家族;糖蛋白染色显示其不含糖链。AmPR-10具有显著的核糖核酸酶活性,且其活性对Na Cl浓度、pH值和金属离子的敏感度低,仅0.5 mol/L NaCl、pH 9.0、Mg^(2+)和Co^(2+)对其有微弱的抑制作用,EDTA对AmPR-10核糖核酸酶活性无影响。结论离子交换色谱-疏水色谱-凝胶过滤色谱3步法纯化AmPR-10快速稳定,可应用于其他中药蛋白质的分离纯化。AmPR-10可能在蒙古黄芪抵御RNA病毒侵染中发挥重要作用。