福寿螺β-葡萄糖苷酶的分离纯化及性质的初步研究

以福寿螺内脏为材料，经本实验室开发的工业生产法制备粗酶粉，进一步采用葡聚糖凝胶（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００）和ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０柱层析纯化，获得经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一纯的β－葡萄糖苷酶制剂．测定该酶的最适反应温度为４３℃，最适反应ｐＨ为５．１；在ｐＨ５．１，４５℃下，该酶催化水杨素水解的Ｋｍ值为３．４０ｍｍｏｌ／Ｌ，活化能为５０．６３ｋＪ／ｍｏｌ．研究几种效应物对酶活力的影响，结果表明：Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋对酶有激活作用，而Ｃｕ２＋、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋、ＳＤＳ及脲对酶有不同程度的抑制作用，其中Ｃｕ２＋和Ｈｇ２＋对该酶的抑制作用最强。

福寿螺纤维素酶的开发与应用

以福寿螺内脏为材料 ,制备纤维素酶粉。测定各组分的酶活力分别为 :内切葡聚糖酶 2 0 .6 5万U/ g ;( β 葡萄糖苷酶 4.2 4万U/ g ;外切葡聚糖酶 0 .48万U/g ;酶粉的蛋白质含量为 37.6 9%、水分为 7.96 %、灰分为 1 .78%。以花生壳作为纤维素酶作用对象 ,测定酶促反应的最适pH为 5 .2 6 ,最适温度为 5 2℃。在 pH5 .2、40℃下 ,纤维素酶作用于花生壳生成葡萄糖 ,在 2h内葡萄糖的生成量与反应时间成正比关系 ,然后逐渐缓慢 ;随着酶浓度的增大 ,葡萄糖的量也呈直线上升 ,说明从福寿螺分离得到的纤维素酶能有效地水解花生壳转化为可被利用的葡萄糖。

福寿螺β-葡萄糖苷酶在脲溶液中失活动力学研究

研究福寿螺β－葡萄糖苷酶在脲溶液中变性作用，测定酶在脲溶液中的失活动力学，测定游离酶（Ｅ）和酶－底物络合物（ＥＳ）的脲失活的微观速度常数，并加以比较，表明底物存在对于酶被脲的失活具有明显的保护作用．

福寿螺β-葡萄糖苷酶催化功能基团

应用化学修饰法研究福寿螺β－葡萄糖苷酶活性功能基团的性质．用５，５′－二硫代双（２－硝基苯甲酸）和对－氯汞苯甲酸为修饰剂修饰酶分子中的巯基，酶活力基本不受影响，说明该酶不是“巯基酶”．用Ｎ－溴代琥珀酰亚胺在ｐＨ６．０下修饰酶后，可使酶活力完全丧失，被修饰后的酶分子在２７８ｎｍ处的紫外吸收峰逐渐下降至完全消失，３３８ｎｍ处的荧光发射峰也逐渐下降至完全淬灭，说明色氨酸残基是酶活性必需基团之一．用碳二亚胺、溴代乙酸或甲醛修饰酶，可以使酶活力完全丧失，说明羧基、组氨酸的咪唑基及赖氨酸的氨基也与酶活性有密切的关系．用乙酰丙酮、苯甲磺酰氟修饰酶，酶活力不受影响，表明精氨酸残基和羟基与酶活性无关．

毛柄金钱菌gpd启动子驱动福寿螺纤维素酶基因在灰盖鬼伞菌中的表达

为研究毛柄金钱菌gpd启动子驱动福寿螺纤维素酶基因(mfc)在大型丝状真菌中的表达效果,本实验通过构建毛柄金钱菌gpd启动子驱动的mfc基因的真核表达载体,采用PEG(polyethylene glycol)介导法将目的基因重组进色氨酸营养缺陷型灰盖鬼伞菌染色体,对转化子进行PCR、Southern blotting、RT-PCR等分子鉴定,通过测定滤纸酶、CMC酶和木聚糖酶的活力考察mfc的表达效果。结果表明:多功能纤维素酶基因整合入灰盖鬼伞基因组中,毛柄金钱菌gpd启动子能够高效驱动mfc基因的表达,其中酶活力最高的工程菌株为Cfvlm9,其滤纸酶活力、CMC酶活力和木聚糖酶活力分别为21.5、44、235U/mL,分别是对照的1.79倍、1.6倍和2.97倍。