基于疾病与活性化合物靶点网络研究牛舌草治疗大鼠脑缺血-再灌注损伤的作用

目的基于脑缺血-再灌注损伤与牛舌草中活性化合物靶点网络,研究牛舌草治疗大鼠脑缺血-再灌注损伤的作用及机制。方法采用线栓法制备脑缺血-再灌注损伤大鼠模型,缺血1.5 h再灌注24 h,对大鼠神经功能进行评分,2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)测定大鼠脑梗死体积。采用网络药理学的分子网络分析技术、蛋白质-蛋白质相互作用网络、基因本体(GO)生物过程富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析、分子对接等方法研究牛舌草治疗脑缺血-再灌注损伤作用机制。结果牛舌草给药治疗能够显著改善脑缺血-再灌注损伤引起的神经行为功能障碍,减轻脑组织病理损伤。并且牛舌草能够通过143个缺血性脑卒中相关靶点,调控炎症反应、细胞凋亡等生物过程,干预肿瘤坏死因子信号通路、血管内皮生长因子信号通路和缺氧诱导因子-1信号通路等发挥作用。结论网络药理学及动物实验表明,牛舌草通过多靶点、多机制整体联合治疗脑缺血-再灌注损伤,可有效降低脑损伤和保护神经功能。

意大利牛舌草化学成分及药理作用研究进展

意大利牛舌草为紫草科牛舌草属多年生草本植物的地上部分,具有生湿生热、调节异常黑胆质等功效,用于心悸、失眠、神志不安、头痛、反应迟钝、大便秘结。现代药理学研究表明其具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌、中枢神经系统作用、内分泌作用等生物活性。意大利牛舌草化学成分包括甾体、挥发油、生物碱、鞣质、油脂、三萜、黄酮和多酚类化合物。本文通过查阅近期国内外相关文献,从化学成分和药理作用两方面对意大利牛舌草进行文献综述,以期为该属植物的进一步研究提供参考。

HPLC双波长法同时测定意大利牛舌草中3种成分的含量

目的建立同时测定意大利牛舌草中咖啡酸、芦丁和紫云英苷含量的HPLC法。方法采用πNAP COSMOSIL C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);以乙腈(A)-2mL·L-1磷酸(B)为流动相,进行梯度洗脱;流速:1.0mL·min^(-1);柱温:30℃;紫云英苷、咖啡酸和芦丁的检测波长分别为266,341和341nm。结果咖啡酸、芦丁和紫云英苷分别在0.348 8~22.32(r=0.999 9),1.813~116.0(r=0.999 9)和0.241 3~15.44μg·mL^(-1)(r=0.999 8)范围内质量浓度与峰面积线性关系良好,平均回收率分别为99.6%(RSD=1.28%),101.1%(RSD=0.66%)和99.8%(RSD=3.75%)。3批意大利牛舌草样品中咖啡酸、芦丁和紫云英苷的平均含量分别为84.27±2.19,720.77±62.85和63.63±4.33μg·g^(-1)。结论该方法操作简便、重复性好、准确度高,为意大利牛舌草的质量控制提供了实验依据。

多指标综合评分法优选意大利牛舌草总黄酮的提取工艺

目的优选意大利牛舌草总黄酮的提取工艺。方法以总黄酮提取率、芦丁提取率及出膏率为考察指标,采用两种多指标综合评分法及L9(34)重复正交试验设计,优选意大利牛舌草回流提取法的工艺条件。结果用于测定提取物中总黄酮含量与芦丁含量的测定方法均符合方法学要求。意大利牛舌草总黄酮回流提取法优选工艺条件为:料液比1∶20;提取温度100℃;乙醇体积分数75%;提取2次,每次2 h。结论验证试验表明优选出的提取工艺简便、合理、可行,为后续研究奠定了基础。

意大利牛舌草中芦丁的分离及定量分析研究

目的确定意大利牛舌草中芦丁的分离方法并建立用于测定意大利牛舌草中芦丁含量的HPLC方法。方法采用硅胶柱色谱对意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物进行分离纯化。建立测定意大利牛舌草中芦丁含量的反相高效液相色谱法,色谱条件：色谱柱Kromasil C18（5μm,250mm×4.6mm）;以乙腈-0.2%磷酸水溶液进行线性梯度洗脱：0～9min 83%～80%B,9～20min 80%～68%B,20～40min 68%～40%B,40～45min 40%～83%;流速1.0mL/min;检测波长354nm,柱温30℃。结果通过分离鉴定在意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物中得到单体化合物1,1 H-NMR与13 C-NMR结果提示其化合物1为芦丁。在1.64×10^（-3）～5.255×10^（-2 ）mL/min范围内芦丁浓度与其峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 7）,且不同批次的意大利牛舌草中的芦丁含量最低,为（1.299 7±0.014 1）mg/g。结论首次从意大利牛舌草中分离得到芦丁,所建立的用于测定芦丁含量的HPLC法简便、准确,重现性好,结果准确可靠,为提高意大利牛舌草的质量标准奠定了试验基础。

意大利牛舌草总黄酮及四种化学成分对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及机制研究

目的探讨意大利牛舌草总黄酮及四种化学成分对心肌细胞缺氧/复氧损伤(hypoxia-reoxygenation,H/R)的保护作用及作用机制。方法分离并培养原代乳鼠心肌细胞,随机分组,建立H/R模型,给药后测定相关指标。结果与模型组相比,总黄酮及四种化学成分均能增加心肌细胞缺氧/复氧损伤后的存活率(P<0.01),降低LDH漏出量(P<0.01),减少细胞内MDA的含量(P<0.01),且SOD活力显著性提高(P<0.01),可显著降低心肌细胞早期凋亡指数,提高线粒体膜电位(P<0.01)。给药组NF-κB信号通路关键蛋白的激活受到抑制,Bax/Bcl-2比例明显降低(P<0.01),Beclin-1蛋白表达量明显降低而p62表达上调(P<0.01),焦亡相关蛋白NLRP3、IL-1β以及GSDMD明显降低(P<0.01)。结论意大利牛舌草总黄酮及四种化学成分可通过抑制NF-κB信号通路的激活及心肌细胞的过度自噬,缓解细胞焦亡,减少心肌细胞凋亡,减轻H/R对心肌细胞造成的损伤。

意大利牛舌草化学成分的初步研究

[目的]初步研究意大利牛舌草地上部分的化学成分。[方法]采用系统预试法对石油醚提取液、乙醇提取液、酸性乙醇提取液和水提取液进行研究,对其可能的化学成分进行初步确定。[结果]意大利牛舌草中可能含有甾体、三萜类、挥发油、酚类、鞣质、黄酮类、香豆素、内酯类、生物碱、糖类、氨基酸、蛋白质、皂苷类化合物等化学成分。[结论]初步确定意大利牛舌草可能含有的化学成分,为意大利牛舌草的后续研究奠定础基。

意大利牛舌草不同极性溶剂萃取物对大鼠缺氧/复氧心肌细胞氧化应激损伤作用的研究

目的研究意大利牛舌草(Anchusa italica Retz)不同极性溶剂萃取物对大鼠对缺氧/复氧心肌细胞(myocardial cells,MCs)氧化应激损伤保护作用的影响。方法模拟缺血再灌注损伤,建立体外培养心肌细胞缺氧/复氧模型,分为12组,正常对照组,缺氧/复氧模型组,阳性对照组,处理组包括:高、中、低剂量乙酸乙酯萃取物+缺氧/复氧模型组;高、中、低剂量正丁醇萃取物+缺氧/复氧模型组;高、中、低剂量水萃取物+缺氧/复氧模型组。采用MTT法测定心肌细胞存活率;酶标仪检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平及细胞内的丙二醛(MDA)含量和细胞内超氧化物歧化酶(SOD)的活力。结果与缺氧/复氧模型组比较,意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物高剂量组、正丁醇萃取物高剂量组、水萃取物高剂量组心肌细胞存活率升高,LDH水平及MDA含量降低,SOD活力提高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水萃取物对缺氧/复氧心肌细胞的损伤具有保护作用,其机制可能与平衡氧化应激产物和抗氧化应激的酶系统有关。

不同产地意大利牛舌草中芦丁和山奈酚的含量测定及其抗补体活性研究

目的:测定不同产地意大利牛舌草中芦丁和山奈酚的含量和其抗补体活性研究。方法:采用UPLC法,色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm);流动相为甲醇(A)-0.4%甲酸(B);洗脱程序(0~3 min,5%~31%A;3~10 min,31%~37%A;10~12 min,37%~40%A;12~30 min,40%~40%A),柱温30℃;检测波长366 nm。通过溶血试验评价芦丁和山奈酚的抗补体活性。结果:意大利牛舌草中芦丁和山奈酚的含量分别在1.25-3.34 mg/g和2.86-6.05 mg/g范围内,且芦丁和山奈酚均具有较好的抗补体活性。结论:意大利牛舌草中2种主要活性成分的含量同地区之间差异较小,不同地区之间存在差异,且这两种成分均具有较好的抗补体活性。

一测多评法测定大鼠肠温孵液中意大利牛舌草4种成分的含量

目的建立大鼠肠温孵液中意大利牛舌草4种成分(芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、迷迭香酸)的一测多评方法(Quantitative Analysis of Multi-components by Single-marker,QAMS)。方法采用聚酰胺柱色谱对意大利牛舌草粗提物进行纯化。建立同时测定大鼠肠温孵液中意大利牛舌草提取物主要成分芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的高效液相色谱定量分析方法。以芦丁为内参物,测定大鼠肠温孵液中意大利牛舌草提取物主要成分芦丁与山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的相对校正因子(Relative Correction Factor,RCF),利用RCF进行含量计算(计算值),并与外标法(External Standard Method,ESM)的测定结果(实测值)进行比较,对该方法进行可行性验证。结果采用ESM法测定8个批次的大鼠肠温孵液中意大利牛舌草提取物主要成分芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的平均含量分别为14.20、15.88、9.80、66.90 mg/g。在线性范围内,芦丁与山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的RCF分别为0.983、1.101、0.843(RSD值均<2%)。利用RCF计算得山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的平均含量分别为15.67、9.87、67.44 mg/g,两种方法的含量测定结果基本一致(相对偏差均<2%)。结论一测多评法简便、准确、可行,可用于大鼠肠温孵液中意大利牛舌草提取物山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的含量测定。

意大利牛舌草提取物抗炎镇咳与体外抑菌作用

目的研究意大利牛舌草提取物抗炎镇咳及体外抑菌作用,为临床应用提供科学依据。方法采用角叉菜胶致大鼠足趾肿胀实验,观察意大利牛舌草不同提取物的抗炎作用;采用浓氨水诱导小鼠止咳实验,观察不同提取物的镇咳作用;采用试管稀释法,评价不同提取物对5种菌株(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌)的体外抑菌作用。结果意大利牛舌草0.63 g·kg^(-1)、2.52 g·kg^(-1)乙醇提取部位、2.52 g·kg^(-1)乙酸乙酯与正丁醇部位在致炎后的不同时间段内抑制大鼠足趾肿胀程度显著(P<0.01),2.52 g·kg^(-1)乙醇提取部位抑制炎症效果与地塞米松组作用相当,正丁醇部位与乙醇部位的抑制炎症效果差异无统计学意义;小鼠镇咳实验中,0.90 g·kg^(-1)、3.04 g·kg^(-1)乙醇提取部位与3.04 g·kg^(-1)正丁醇部位的延长小鼠咳嗽潜伏期作用与急支糖浆差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),且上述部位的3.04 g·kg^(-1)剂量组小鼠咳嗽次数明显减少(P<0.05);4种意大利牛舌草提取物分别对枯草芽孢杆菌具有抑菌活性,其中乙酸乙酯部位与水溶部位的抑制作用较强。结论意大利牛舌草乙醇提取部位及正丁醇部位具有抗炎,镇咳的药理活性,而乙酸乙酯部位对枯草芽孢杆菌具有体外抑制活性。

星点设计-响应面法优化意大利牛舌草总皂苷提取工艺

目的采用星点设计-响应面法优化意大利牛舌草总皂苷提取工艺。方法采用单因素试验研究乙醇浓度、液料比、回流提取时间及回流提取次数对意大利牛舌草总皂苷提取效果的影响。在单因素试验结果基础上,采用星点设计-响应面法优选意大利牛舌草总皂苷提取工艺。结果优选出的意大利牛舌草总皂苷提取工艺为:提取溶剂为80%乙醇,液料比14∶1(mL∶g),回流提取1 h,提取2次,总皂苷含量为(203.04±1.36)mg/g (RSD=0.67%),与预测值之间的相对误差为1.04%。结论星点设计-响应面法优化意大利牛舌草总皂苷提取工艺方法简便,结果可靠,预测性良好。

意大利牛舌草对咳嗽变异性哮喘大鼠TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的 研究意大利牛舌草提取物对咳嗽变异性哮喘(CVA)的作用,及其作用机制。方法 将48只SD大鼠随机分为空白组、模型组、对照组和实验A1、A5、A7组,每组8只。除空白组外,其余各组用卵蛋白-完全弗氏佐剂进行造模。造模成功后,空白组与模型组均灌胃给予等量0.9%NaCl;对照组灌胃给予250 mg·kg^(-1)醋酸泼尼松;实验A1、A5、A7组分别灌胃给予61.1 mg·kg^(-1)意大利牛舌草提取物A1、48.8 mg·kg^(-1)意大利牛舌草提取物A5、201.8 mg·kg^(-1)意大利牛舌草提取物A7,连续灌胃28 d。观察各组大鼠的咳嗽次数,用蛋白质印迹法检测各组大鼠肺组织中Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子(MyD88)和核因子κB(NF-κB)蛋白质表达的变化。结果 空白组、模型组、对照组和实验A1、A5、A7组的咳嗽次数分别为(1.10±0.22)、(8.33±1.24)、(3.08±0.65)、(3.31±0.99)、(3.08±1.02)和(3.06±0.68)次,TLR4蛋白相对表达水平分别为0.61±0.01、0.84±0.04、0.66±0.02、0.64±0.04、0.64±0.03和0.69±0.02,MyD88蛋白相对表达水平分别为0.54±0.08、0.86±0.06、0.71±0.06、0.65±0.05、0.64±0.08和0.70±0.06,p-NF-κB蛋白相对表达水平分别为0.48±0.11、0.94±0.06、0.80±0.08、0.68±0.04、0.68±0.06和0.78±0.09。模型组的上述指标与实验A1、A5、A7组、对照组和正常组相比,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 意大利牛舌草提取物A1、A5、A7对大鼠的CVA具有抑制作用,其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。

“一标多测”多指标综合加权评分法优选牛舌草有效成分的提取工艺

提出了改进的多指标综合加权评分法,并将该方法用于优选意大利牛舌草中多种有效成分的提取工艺.针对样品中的未知含量分析物,提出了"一标多测"的概念,以意大利牛舌草中的多组成提取为例,选取芦丁为参照即为"一标",以此获得了5种主要指标组分的相对含量,即为"多测".以相对含量作为综合评价指标,通过对主要影响因素,包括提取溶剂、浸泡时间、超声时间、料液比等4个因素进行了正交试验优选.由此获得最佳提取工艺为:采用80%甲醇提取,浸泡12 h,超声10 min,料液比为1∶50.结果表明,"一标多测"解决了样品中被测物真实含量未知的问题,多指标综合加权评分法实现了实际样品未知含量分析物提取条件的优选.二者结合简便可行,节省试剂,并经过优选意大利牛舌草中多种待测成分的提取工艺得到了证实."一标多测"与多指标综合加权评分法结合对其他中药材中有效成分提取具有借鉴意义.

牛舌草总黄酮通过ROS/TXNIP/NLRP3抑制炎症小体活化抗心肌缺血再灌注损伤

目的从炎症小体活化和活性氧/硫氧还蛋白互作蛋白/NOD样受体蛋白3(ROS/TXNIP/NLRP3)通路考察牛舌草总黄酮(total flavonoids of Anchusa italica Retz.,TF)抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制。方法小鼠采用冠状动脉左前降支结扎模型模拟心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。将模型制备成功的30只小鼠随机分为模型组(I/R)、TF 30 mg·kg^(-1)处理组(I/R+TF30)和100 mg·kg^(-1)处理组(I/R+TF100),再灌同时给予生理盐水、TF。于再灌注24 h时,检测小鼠心功能,测定心肌梗死范围和血清心肌酶谱,心肌冰冻切片染色观察活性氧(ROS)水平,Western blotting分析NLRP3炎症小体活化以及TXNIP与NLRP3相互作用的变化。结果TF在剂量为30和100 mg·kg^(-1)时均可改善心功能,减少心肌梗死范围,降低血清心肌酶水平。另外,TF处理减少心肌炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)α含量,降低心肌ROS水平。TF在30和100 mg·kg^(-1)均显著降低TXNIP、NLRP3、cleaved caspase-1和cleaved IL-1β,并抑制TXNIP/NLRP3相互作用。结论牛舌草总黄酮通过抑制ROS/TXNIP/NLRP3通路,从而减轻NLRP3炎症小体活化,发挥抗心肌缺血再灌注损伤作用。

大孔树脂纯化牛舌草总黄酮的工艺优化

利用单因素试验和正交试验优化大孔树脂纯化牛舌草总黄酮的工艺条件.结果表明,影响NKA-9大孔树脂对牛舌草总黄酮吸附能力的各个因素影响力大小为B>C>A,样品pH值对大孔树脂吸附能力影响显著(P<0.05),而乙醇浓度与样品流速对大孔树脂吸附能力影响不显著.确定NKA-9大孔树脂吸附牛舌草总黄酮的最优工艺条件为A1B2C2,即乙醇浓度10%、样品pH值5、样品流速2 BV·h-1.NKA-9大孔树脂对牛舌草总黄酮有较好的纯化效果,且工艺重复性和稳定性良好.