三种水生动物细胞系对两株蛙病毒敏感性的比较

利用3个不同物种的水生动物细胞系,包括爪蟾肾细胞系(A6)、大鲵胸腺细胞系(GSTC)和鲤上皮瘤细胞系(EPC),分别用沼泽绿牛蛙蛙病毒(RGV)和大鲵蛙病毒(ADRV)感染,进一步研究细胞病变显微形态、病毒滴度、细胞病变与不同感染时间的相关性等。结果显示,在光镜下可见感染病毒的细胞发生病变,A6和EPC细胞肿胀或破裂;GSTC细胞收缩或聚在一起形成多层。同种水产动物细胞系对不同蛙病毒的敏感性不同,在A6、EPC和GSTC细胞中,RGV的滴度分别为10^(3.6)、10^(5.9)和10^(6.6) TCID_(50)/m L;ADRV的滴度分别为10^(4.3)、10^(5.4)和10^(6.1) TCID_(50)/m L,表明GSTC细胞系对两种蛙病毒都更敏感。研究为后续蛙病毒致病机理提供了有用的信息和重要实验材料。

大鲵蛙病毒致病分子机制及免疫防控策略研究进展

大鲵(Andrias davidianus),属隐鳃鲵科大鲵属,因其叫声酷似婴儿啼哭俗称“娃娃鱼”,1869年在我国西部首次被发现,为我国独有物种[1]。由于生存环境被破坏、气候变化、人为滥捕滥杀等原因,大鲵曾一度濒临灭绝。20世纪70年代国内开始大鲵的人工繁育与养殖。然而随着大鲵养殖规模扩大,营养搭配不合理以及养殖环境污染等问题频繁出现,大鲵养殖病害问题日益严重。人工养殖大鲵常见疾病包括细菌病、病毒病、寄生虫病等[1],其中,尤以病毒感染最为严重。大鲵感染病毒后发病快,死亡率高,且感染后无特效药物。目前国内报道的造成大鲵病毒性疾病的病毒只有一种,但对其命名尚未统一,有大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV;Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)、大鲵虹彩病毒(Andrias davidianus iridovirus,ADIV;Giant salamander iridovirus,GSIV)等[2-5]。2010年,耿毅等[2]首次在甘肃陇南和陕西汉中患病大鲵内脏中观察到呈晶格状排列的病毒颗粒,分析发现该病毒主要核衣壳蛋白(MCP)基因与蛙病毒3 MCP基因同源性达96%~99%。

大鲵蛙病毒编码96L蛋白(ADRV-96L)的腺苷三磷酸酶活性和促进细胞生长作用

【背景】腺苷三磷酸酶(ATPase,ATP酶)是控制DNA复制起始及宿主对病原微生物的应答开关。近期关于水生动物虹彩病毒基因组学的研究表明,它们共享编码ATPase的基因。【目的】大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV)属于虹彩病毒科,是世界现存最大两栖动物——中国大鲵的致死性病毒病原体。为了鉴定病毒基因及其表达产物对病毒复制和宿主细胞的影响,对ADRV编码ATPase的基因ADRV-96L进行了克隆、表达及功能分析,阐明这个虹彩病毒核心基因的功能。【方法】采用Predic Protein软件分析序列,构建重组原核表达质粒p ET32a/His ADRV-96L,经IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)诱导在大肠杆菌DE3中表达蛋白,用镍树脂纯化和咪唑液洗脱。钼蓝分光光度法检测产生的无机磷(Pi)以确定纯化ADRV-96L的ATPase活性。建立表达蛋白的稳定转染细胞系并进行鉴定,再分别通过绘制病毒的一步生长曲线和评估转染细胞的生长速率来测定该蛋白对病毒复制及细胞生长的影响。【结果】多重序列比对显示ADRV-96L存在含Walker A和Walker B基序的AAA-ATPase(ATPases associated with a variety of cellular activities,与各种细胞活性相关的ATPase)结构域(20-159位氨基酸)及两个高度保守的精氨酸。重组原核质粒表达了含ADRV-96L的52 k D融合蛋白,该蛋白质具有ATPase活性(酶的比活性平均为4.68 U/mg)。结果未检出ADRV-96L对病毒的复制影响,但显示该蛋白可促细胞生长。【结论】大鲵蛙病毒96L基因(ADRV-96L)编码一个促细胞增殖和生长的ATPase。

蛙病毒同源蛋白RGV-27R和ADRV-85L的表达及其免疫原性分析

沼泽绿牛蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)和大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV)同属虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)成员,是引起水产动物高死亡率的病原。其同源早期蛋白RGV-27R和ADRV-85L与蛙病毒代表株蛙病毒3型(Frog virus 3,FV3)25R基因所编码的大小为31kD的早期蛋白P31K(FV3-P31K)同一性超过99%。我们在观察和比较RGV与ADRV感染大鲵胸腺细胞(Giant salamander thymus cell,GSTC)显微病变的基础上,将ADRV-85L和RGV-27R基因分别克隆到原核表达载体pET-32a与pMAL-p5X中,转化宿主菌E·coli BL21(DE3)并诱导表达,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测,对这两种蛋白的原核表达及其产物免疫原性进行分析。结果显示这两种基因在载体pET-32a中的表达效率要显著高于pMAL-p5X。随后,取高效诱导表达的pET-32a-RGV-27R产物,经Ni-NTA His-Bind亲和层析分离提纯,获得浓度为1.2 mg/mL的融合蛋白His-RGV-27R,用其免疫动物,制备了抗体27R-Ab,酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗体的效价为1∶6.25×10~6。用经正常大肠杆菌菌液和正常GSTC细胞悬液吸附处理后的抗体作为一抗,对被RGV或ADRV感染的GSTC细胞悬液进行Western Blot检测,并以重组原核质粒表达的融合蛋白His-RGV-27R和HisADRV-85L作为阳性对照,以正常GSTC细胞悬液为阴性对照,分别从RGV或ADRV感染的GSTC细胞悬液中,检出大小同为31kD的特异性蛋白条带。本研究证实两种蛙病毒同源早期蛋白RGV-27R和ADRV-85L不仅都能在两栖动物细胞中表达,且具有相同的抗原特性,这为深入研究这类病毒蛋白对蛙病毒复制的影响及其与宿主相互作用的分子机制提供了实验材料。