盐知母多糖SAAP-A-1分离纯化及体外抗炎活性研究

目的从盐炙知母粗多糖中分离纯化得到精制盐知母多糖(SAAP-A-1),对其结构和抗炎活性进行研究。方法采用水提醇沉法提取获得盐知母多糖(SAAP),通过阴阳离子交换及DEAE-52纤维素树脂分离纯化得到盐知母多糖SAAP-A-1。采用高效液相色谱法(HPLC)、PMP柱前衍生化超高效液相色谱法、傅里叶红外光谱(FT-IR)分析、UV分析及扫描电子显微镜(SEM)检测等方法对SAAP-A-1进行结构解析;采用CCK-8法检测SAAP-A-1对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖率的影响,ELISA法检测RAW264.7细胞上清中IL-1β、TNF-α、IL-6的含量,RT-PCR法测定IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10、iNOS mRNA的释放水平。结果经HPLC测定SAAP-A-1为均一酸性多糖,主链主要有由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖组成,相对分子质量为3.78×10^(5) Da。体外研究表明,SAAP-A-1可促进RAW264.7巨噬细胞增殖,降低炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、NO含量及TNF-α、IL-1β、iNOS mRNA表达水平;升高抗炎介质IL-4、IL-10 mRNA表达水平。结论SAAP-A-1为首次从盐知母粗多糖中分离得到,可能是盐知母发挥抗炎作用的物质基础。

基于血清药物化学和网络药理学的知母-黄柏药对盐炙前后治疗2型糖尿病药效物质基础及作用机制分析

目的基于液质联用技术对生知母-生黄柏、盐知母-盐黄柏药对水提液灌胃给药后大鼠入血成分分析,结合网络药理学预测盐炙在知母-黄柏药对治疗2型糖尿病的影响,并通过体外实验进行初步验证。方法大鼠连续灌胃给药生知母-生黄柏药对、盐知母-盐黄柏药对水提液2次,中间间隔1 h,末次给药60 min后腹主动脉取血,用甲醇沉淀蛋白法处理后复溶,采用色谱柱Shim-pack GIST C 18(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相A相为0.1%甲酸水,B相为0.1%甲酸-乙腈;梯度洗脱,正、负离子全扫描模式,质量扫描范围m/z 100~1500。结合数据库二级谱图及文献,分析鉴定生知母-生黄柏、盐知母-盐黄柏药对的入血成分。检索2型糖尿病疾病靶点,对入血成分和疾病的交集靶点进行蛋白质互作网络分析、GO、KEGG通路富集分析,构建“入血成分-靶点”网络图,运用AutoDock软件对筛选出的核心成分和核心靶点进行分子对接验证。验证实验以HepG2细胞为实验对象,胰岛素联合高糖诱导胰岛素抵抗模型,CCK8法检验盐炙前后知母-黄柏药对对细胞增殖影响,Western blot检测PI3K-AKT信号通路相关蛋白的表达情况。结果生知母-生黄柏药对水提液大鼠血清中鉴定出15种原型成分,1个芒果苷代谢成分。盐知母-盐黄柏药对水提液大鼠血清中鉴定出17个原型成分,1个芒果苷代谢成分。盐炙后入血成分中芒果苷、小檗碱、3-异丁基戊二酸等成分含量较生品高。KEGG和GO结果显示,知母-黄柏药对治疗2型糖尿病可能与RNA聚合酶的转录调控、炎症反应、AGE-RAGE、PI3K-AKT、胰岛素抵抗等通路有关。细胞实验表明盐炙前后知母-黄柏药对可以上调p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、GLUT4蛋白表达,且盐炙组效果优于生品组。结论初步阐释了知母-黄柏药对盐炙前后入血成分,阿魏酸、小檗碱、小檗红碱、芒果苷与mTOR、SIRT1、EGFR、PPARA等可能是知母-黄柏药对盐炙后增强2型糖尿病治疗效果的主要成分和靶点,其机制可能是增强了PI3K-AKT等相关通路的作用,为知母-黄柏药对盐炙前后药效物质基础研究及临床应用提供重要参考。

加工炮制对知母品质的影响

对知母多种加工、炮制品的化学成分、药效进行了比较，加工炮制可显著影响知母的有效成分含量，知母入药不必去皮；不同的加工炮制品药理作用存在差异，生品的抗炎作用较好，而镇静作用以酒炒、炒知母效果最佳。

盐炙对知母中新芒果苷体内药代动力学的影响

目的:建立测定大鼠血浆中新芒果苷HPLC方法,探究盐炙对知母中新芒果苷药代动力学的影响。方法:色谱柱:Ecosil C_(18)柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:水-乙腈(15:85);流速:1 m L/min;检测波长:258 nm;柱温:30℃。结果:新芒果苷在生品和盐炙品组大鼠体内药代动力学参数分别为:AUC_(0-t)为(43.913±0.636)、(71.565±1.950)mg/L*h;AUC_(0-∞)为(44.127±0.673)、(71.805±1.926)mg/L*h;C_(max)为(4.539±0.048)、(5.805±0.119)mg/L;MRT_(0-t)为(8.124±0.246)、(8.650±0.398)h;MRT_(0-∞)为(8.290±0.321)、(8.761±0.435)h;t_(1/2)为(4.315±0.472)、(3.989±0.301)h。结论:知母盐炙后促进新芒果苷的吸收,并在一定程度上增加了生物利用度。

不同炮制方法对知母中多糖含量的影响

目的比较不同炮制方法对知母中多糖含量的影响。方法采用苯酚-硫酸法测定各供试样品中知母的多糖含量。结果不同炮制方法处理后知母中多糖含量高低依次为盐炙品>清炒品>酒炙品>麸炒品>生品。结论知母经炮制后均有利于多糖的溶出,其中以盐炙品含量最高。

正交试验法优选知母盐炙工艺

目的:优选知母的最佳盐炙工艺。方法:以芒果苷含量为考察指标,选择炒制时间、炒制温度及加盐水量3个因素,用L9(34)正交设计表,采用方差分析对知母的盐炙工艺优选。结果:炒制时间因素具有显著差异,其余两因素对芒果苷含量无显著影响。结论:知母最佳盐炙工艺为:每100 kg知母在160℃下加10 kg盐水(浓度为20%),炒制4 min。

正交试验法优选知母水处理工艺

目的优选知母的最佳水处理工艺。方法以芒果苷含量为考察指标,选择加水量、浸泡温度、浸泡时间和润制时间等4个因素,用L9(34)正交设计表,采用方差分析优选知母的水处理工艺。结果4个因素对芒果苷的含量均无显著性影响。结论知母最佳水处理工艺为:加20倍水,在30℃下浸泡0.5 h后捞出,润制4 h。

知母盐制前后对α-葡萄糖苷酶抑制作用比较

目的 比较知母和盐知母提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,从体外方面探讨知母不同炮制品的降血糖作用.方法 以对-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）为底物,采用HPLC法分析水解产物中的对-硝基酚（PNP）浓度,比较知母、盐知母5种不同浓度的水煎液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用.结果 在低浓度下,各组均表现出较弱的抑制作用;在2.6 ～65mg/ml浓度下,知母、盐知母水煎液均表现出一定的抑制作用,盐知母抑制作用强于知母,与浓度呈正相关,且优于阳性对照阿卡波糖.结论 知母和盐知母均能抑制α-葡萄糖苷酶的活性,盐制后作用增强.

知母微波炮制工艺的研究

目的研究盐制知母的微波炮制工艺。方法采用正交试验,以芒果苷及知母皂苷BⅡ的含量为评价指标,确定最佳的微波炮制工艺。结果盐制知母的最佳的炮制工艺为:盐的用量为2kg,闷润40min,微波热力60%,微波时间为2min。结论该方法简单、可行而且易于控制,可作为知母炮制的新方法。

多指标优化百合知母浓煎剂提取工艺

目的:研究百合知母浓煎剂的提取过程,优化提取工艺。方法:以提取液中芒果苷和总多糖的含量为考察指标,采用L9(33)正交试验设计方法,确定提取工艺中加水量、提取时间、提取次数参数。结果:最佳的提取工艺为加水量10倍,提取时间3 h,提取2次,综合评分值为0.830。结论:此方法可行,适合工业的生产。

HPLC-CAD法测定知母盐炙前后4种皂苷含量

目的比较知母盐炙前后4种皂苷含量的变化,解析盐知母降血糖增强的炮制原理。方法采Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);以乙腈-水梯度洗脱,流速为1 ml/min,Corona参数:氮气压力为35 psi (约241.3 Kpa),Filter:High, Range:200 pA。结果知母皂苷BⅡ、知母皂苷E、知母皂苷BⅢ和知母皂苷AⅢ进样质量分别在0.863～4.18μg(r=0.999 3)、0.848～4.24μg(r=0.999 3)、1.060～5.30μg(r=0.999 5)、1.092～5.46μg(r=0.999 7)的范围内与峰面积呈良好线性关系;知母皂苷E的含量降低,知母皂苷BⅢ和知母皂苷AⅢ升高。结论该含量测定方法简单、灵敏、准确。盐炙可使知母皂苷类成分发生转化,是盐知母降血糖作用增强的物质基础之一。

复幼方药味配伍对盐知母中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷提取率及稳定性的影响

目的探究复幼方药味配伍对盐知母中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷提取率及稳定性的影响。方法建立复幼方中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷的HPLC测定方法,通过复幼方整体提取和方中各药味与盐知母分别配伍提取,考察不同药味配伍对盐知母中3种成分提取率和稳定性的影响。结果较盐知母单独提取,复幼方全方提取后,新芒果苷、异芒果苷提取率增加,芒果苷提取率降低;各药味与盐知母分别配伍提取后,生地黄-盐知母组、泽泻-盐知母组新芒果苷的提取率降低,地骨皮-盐知母组、生地黄-盐知母组芒果苷的提取率降低,各组异芒果苷的提取率均高于盐知母单独提取。与0 h测得的含量相比,复幼方水提液放置48 h后,新芒果苷含量较稳定,芒果苷含量降低为84.04%,异芒果苷含量升高。关黄柏-盐知母配伍水提液放置48 h后新芒果苷稳定性降低;芒果苷、异芒果苷在地骨皮-盐知母配伍水提液中不稳定,放置48 h后含量分别降低8.37%、9.99%;夏枯草-盐知母配伍水提液放置48 h后,3种成分的含量呈不同程度下降。结论复幼方煎煮提取过程中主要是生地黄、地骨皮影响了新芒果苷、芒果苷、异芒果苷的提取率,提取液放置过程中主要是关黄柏、地骨皮、夏枯草影响了该3种成分的稳定性,不同的药味配伍及配伍比例是影响复方中有效成分含量的关键因素。

知母-黄柏药对盐炙前后HPLC指纹图谱及多指标成分含量变化

目的建立知母-黄柏药对盐炙前后HPLC指纹图谱,对11种指标性成分进行定量分析,探索药对盐炙前后的质量差异。方法采用HPLC法建立知母-黄柏药对盐炙前后指纹图谱,通过化学计量学方法对知母-黄柏药对盐炙前后指纹图谱进行分析;并采用HPLC法测定知母-黄柏盐炙前后药对中新芒果苷、绿原酸、隐绿原酸、黄柏碱、芒果苷、木兰花碱、药根碱、小檗红碱、小檗碱、柠檬苦素、黄柏酮的含量。结果10批知母-黄柏药对盐炙前后HPLC指纹图谱组内相似度均>0.988,聚类分析、偏最小二乘法-判别分析可明显将生知母-生黄柏、盐知母-盐黄柏分为2类,小檗碱、新芒果苷、芒果苷、小檗红碱、黄柏碱等成分可能是引起两者质量差异的主要标志成分。定量分析显示,知母-黄柏药对盐炙后芒果苷、黄柏碱、药根碱、小檗红碱、小檗碱的含量增加,而新芒果苷、绿原酸、隐绿原酸的含量降低,柠檬苦素的含量亦有降低趋势,木兰花碱、黄柏酮的含量无明显变化。结论所建立的指纹图谱及多指标含量测定方法稳定可靠,从定性与定量评价了知母-黄柏药对盐炙前后的质量差异;为知母-黄柏药对药味炮制研究提供一定的依据。

基于多指标权重分析及正交试验优选知母炮制工艺

目的采用多指标正交试验优选生知母与盐知母炮制工艺。方法利用层次分析法(AHP)对新芒果苷、芒果苷及异芒果苷进行分析;在单因素基础上,结合正交试验考察润制时间、烘制温度、烘制时间对生知母质量的影响以及闷润时间、炒炙温度、炒炙时间对盐知母质量的影响,优选生知母和盐知母炮制工艺的技术参数。结果优选生知母炮制工艺参数为:润制时间20 h,烘制温度70℃,烘制时间8 h;优选盐知母炮制工艺参数为:闷润时间50 min,炒炙温度100~110℃,炒炙时间8 min。结论优选出的知母炮制工艺稳定可行,为知母规范化生产提供依据。

基于网络药理学探讨姜知母干预肺寒湿咳的作用机制

基于网络药理学、分子对接技术和实验验证探讨姜知母干预“肺寒湿咳”的作用机制,为姜知母治疗肺寒湿咳这一传统用法提供现代药理学依据。使用中药系统药理学数据库分析平台(TCMSP),根据类药性原则选择口服生物利用度(OB≥30%)、药物相似性(DL≥0.18)作为筛选条件并结合相关文献来获得姜知母活性成分,建立姜知母活性成分库;采用SwissTargetPrediction数据库预测活性成分的潜在靶点;通过SymMap数据库筛选到中医证候“肺寒湿咳”对应西医症状为急性支气管炎;从人类基因数据库(GeneCards)和在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)获得急性支气管炎疾病的相关靶点;利用Venny数据库获取成分与疾病的交集靶点;利用STRING平台和Cytoscape软件构建交集靶点的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络;借助DAVID数据库对潜在治疗靶点进行GO功能富集和KEGG通路分析;采用AutoDock等软件对部分活性成分与潜在靶点进行分子对接验证;最后采用烟熏加寒冷刺激法制备小鼠急性支气管炎疾病模型进行验证。该研究共筛选出姜知母活性成分潜在作用靶点557个,药物-疾病共同靶点157个,富集分析得到1072个GO功能富集条目和169个KEGG通路富集条目;分子对接结果显示活性成分和MAPK14、MMP3蛋白有较好的结合能力,活性成分中结合能力最强的是timosaponin AⅢ;体内动物实验表明,除生知母低剂量组、生知母高剂量组、姜汤组外,其余各给药组均可减轻小鼠肺组织病变,减轻炎症细胞浸润,降低小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-1β、IL-18、TNF-α炎症因子水平,下调小鼠肺组织MAPK14、MMP3 mRNA及MAPK14、MMP3蛋白的表达,且姜知母的改善效果优于生知母。该研究利用网络药理学和实验验证初步揭示了姜知母可通过调控IL-17、TNF等信号通路,抑制炎症反应,达到治疗肺寒湿咳的作用,验证了姜知母治疗肺寒湿咳这一传统用法的科学性,为姜汤浸知母传统特色炮制工艺的传承和临床应用提供科学依据。

模拟炮制及实验证据揭示知母盐炙后增强滋阴降火作用的机制

目的:研究知母盐炙后化学成分转化以及滋阴降火作用增强的机制。方法:首先采用HPLC法比较生知母和盐知母之间化学成分的差异,结合模拟炮制实验进行验证,阐明炮制引起的化学变化;其次建立甲状腺素诱导的大鼠肾阴虚模型,评价生、盐知母及增量成分芒果苷治疗肾阴虚的效果。采用Western Blot和RT-PCR检测药物对PI3K/AKT/mTOR信号通路的表达影响。结果:知母盐炙后新芒果苷含量下降,芒果苷含量升高;在模拟盐炙新芒果苷单体及饮片中均出现了芒果苷色谱峰,证明盐炙可促使新芒果苷向芒果苷转化;生知母、盐知母和芒果苷均可治疗肾阴虚证,但盐知母和芒果苷治疗肾阴虚证的效果明显优于生知母,证明芒果苷是知母发挥治疗肾阴虚作用的活性成分之一;生知母、盐知母和芒果苷均能上调肾阴虚证大鼠PI3K、AKT、mTOR mRNA和蛋白的表达,且芒果苷的作用明显优于生知母。结论:知母盐炙后芒果苷含量增加,并通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路增强知母对肾阴虚证的治疗作用。

基于炮制学理论初探知母润肠通便作用的有效成分

该实验对知母盐炙前后水煎液通便作用及化学成分进行比较研究,通过观察生、盐知母水煎液对便秘大鼠的通便作用,采用超高效液相-质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术对知母盐炙前后化学成分进行比较,苯酚硫酸法测定其总糖含量。盐知母水煎液低、中、高剂量组使大鼠粪便粒数显著增加,与同等剂量生知母相比有显著差异(P<0.05);总离子流图比较无明显差异,但总糖含量明显高于生知母。结果表明,知母盐制品在同等剂量时通便作用明显强于生品,与其盐制后甘味的作用增强有关,是其滋阴降火作用增强的具体体现;糖类化合物可能是其滋阴降火作用的物质基础,也是知母甘味的物质基础。

知母盐炙前后滋阴作用比较

目的:比较知母、盐知母对甲亢阴虚大鼠的影响,以阐明盐知母增强滋阴降火作用的炮制原理。方法:SD雄性大鼠,随机分为空白对照组,模型对照组,生知母、盐知母低剂量组(1 g·kg-1),生知母、盐知母高剂量组(2 g·kg-1);各组大鼠每天ig甲状腺素溶液(1.25×10-2g·kg-1)与相应样品水煎液(10 mL·kg-1),空白组ig等体积的生理盐水,模型组ig等体积的甲状腺素溶液和生理盐水,连续3周,眼眶取血,分离血清,抗原抗体反应法测游离三碘甲状腺原氨酸(FT3),游离甲状腺素(FT4),收集尿液,取上清液,紫外-可见光分光光度计(410 nm)测定17-羟皮质类甾醇(17-OHCS)的含量。结果:与空白组比较,模型组的FT3,FT4均显著升高(P<0.01);与模型组比较,除生品低剂量组的FT3外,其余各给药组的FT3,FT4均有显著性差异(P<0.05或P<0.01);各给药组尿17-OHCS均有下降趋势,盐知母高剂量组与模型组比较有显著性差异(P<0.01),优于生知母组;与生知母等剂量组比较,盐知母各剂量组FT3,FT4及尿17-OHCS均低于生知母组,其中盐知母高剂量组的17-OHCS较生知母有显著性差异(P<0.05)。结论:知母、盐知母均有滋阴作用,盐炙后作用增强。

盐知母降血糖活性部位作用研究

目的:对前期筛选出的盐知母活性部位的降糖作用进行深入研究,进一步证明其降血糖作用,为后期研发提供依据。方法:采用HPLC法,以PNPG(对硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷)为底物测定α-葡萄糖苷酶的反应产物PNP(对-硝基酚)的浓度,比较盐知母不同降血糖活性部位(乙酸乙酯层萃取物、三氯甲烷层萃取物)对α-葡萄糖苷酶的抑制作用;采用脂肪乳加腹腔注射STZ(链脲佐菌素)诱导2型糖尿病大鼠模型,并随机分组,灌胃14 d后测定空腹血糖值(FBG),并用试剂盒测定胰岛素、血清三酰甘油、总胆固醇等水平。比较盐知母不同降血糖活性部位对2型糖尿病大鼠降血糖效果。结果:盐知母降血糖活性部位均对α-葡萄糖苷酶有抑制作用,且盐知母三氯甲烷层萃取物优于乙酸乙酯层萃取物;与模型组相比,各给药组均显著改善FBG、OGTT、HbAlc、Homa-IR等水平及TC、TG等血脂水平。结论:盐知母三氯甲烷层萃取物对α-葡萄糖苷酶有明显抑制作用,对2型糖尿病大鼠具有降血糖和降血脂作用,是盐知母降血糖的活性部位。

知母与盐知母对甲亢阴虚大鼠红细胞膜Na^+-K^+-ATP酶影响的比较研究

目的:比较知母及盐知母对甲亢阴虚大鼠红细胞膜Na+-K+-ATP酶活力的影响,从能量代谢方面探讨知母盐炙后增强滋阴降火作用的炮制原理。方法:SD大鼠,雌雄各半,随机分为空白组,模型组,六味地黄丸组(2.2 g.kg-1),生知母、盐知母高剂量组(2 g.kg-1),生知母、盐知母低剂量组(1 g.kg-1);各组大鼠每天上午ig甲状腺素液2 mL(1.25 g.L-1),空白组ig生理盐水;下午各给药组ig相应的药液(10 mL.kg-1),空白组、模型组ig等体积生理盐水,3周后测定红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性。结果:与模型组相比,生知母及盐知母各剂量组均能显著降低Na+-K+-ATP酶的活性(P<0.05),其中低剂量组盐知母作用优于生知母(P>0.05);高剂量组结果相反,即盐炙后作用降低(P>0.05),且高剂量组作用弱于低剂量组(P<0.05)。结论:知母及盐知母均具有滋肾阴清虚热的作用。