应用酵母双杂交系统筛选新基因AngRem104相关蛋白

目的 :应用酵母双杂交系统筛选与新基因AngRem10 4相互作用的蛋白 ,为该基因的功能研究提供线索。方法 :构建AngRem10 4的真核表达载体AngRem10 4 pGBKT7/c myc,转化酵母菌AH10 9,Westernblot证实蛋白表达 ,进行毒性和自激活检验 ,与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合 ,筛选与AngRem10 4相互作用的蛋白。结果 :AngRem10 4蛋白能在酵母中正常表达 ,对酵母细胞无毒性 ,不存在自激活现象。筛选出的蛋白包括真核翻译延伸因子 1α1、糖皮质激素受体AF 1特异延伸因子、β2 微球蛋白、巴戴 -比德尔综合征 2蛋白及 4个与细胞代谢有关的蛋白。结论 :AngRem10 4可能影响细胞内某些转录因子活性和细胞代谢 ,并与某些免疫相关疾病和遗传病发病有关。酵母双杂交结果为AngRem10

AngRem104基因与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及在COS-1细胞中的表达定位

构建以绿色荧光蛋白 (Greenfluorescenceprotein ,GFP)为报告基因的重组表达质粒AngRem10 4 pEGFP N1,利用脂质体转染体外培养的COS 1细胞 ,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察AngRem10 4 EGFP融合蛋白在细胞中的分布和定位 ,用RT PCR和Westernblot方法验证其mRNA和蛋白的表达。结果表明在空载体pEGFP N1转染组中 ,COS 1细胞内绿色荧光呈弥散分布 ;重组质粒AngRem10 4 pEGFP N1转染组中 ,绿色荧光集中在细胞核中 ,随着表达量的增高 ,绿色荧光在细胞核中聚集成团块状、颗粒状。RT PCR的结果表明AngRem10 4在重组质粒转染组中的表达明显高于空载体和空白对照组。Westernblot的结果也确证了AngRem10 4 EGFP融合蛋白的表达。提示新基因AngRem10 4 /pEGFP融合基因真核表达载体在真核细胞COS 1中获得了表达 ,细胞所表达的融合蛋白具有An gRem10 4和EGFP的双重活性 ,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位 ,为基因功能研究提供了线索。

人肾小球系膜细胞增生硬化相关新基因AngRem104的表达和功能研究

目的 :AngRem10 4 (angiotensinⅡrelatedgenesinmesangialcells)是血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )刺激系膜细胞后上调表达的新基因 (GenBank登录号是AF36 7870 )。本研究旨在进一步探讨新基因AngRem10 4的功能 ,为研究肾小球增生硬化可能的分子机制奠定基础。方法 :用Northernblot检测AngRem10 4在正常人组织中的表达分布及其在AngⅡ刺激和刺激被losartan阻断后的表达变化。构建AngRem10 4与pcDNA3 1/V5 /His -TOPO的正义和反义真核表达载体 ,并转染至体外培养人肾小球系膜细胞 ,用RT -PCR的方法检测在AngRem10 4基因过度表达时纤粘连蛋白(FN)的表达变化。通过ExPASy对AngRem10 4进行生物信息学分析。结果 :生物信息学分析提示AngRem10 4是一种核蛋白。Northernblot结果显示AngRem10 4在正常人心脏、胎盘、肝脏、骨骼肌、肾脏和胰腺组织中广泛的表达 ,而在脑组织和肺中未检测到表达。在AngⅡ刺激人系膜细胞后 6h ,AngRem10 4表达明显上调 ,并可持续至 4 8h ,但却剂量依赖地被AngⅡI型受体 (AT1R)拮抗剂 (losartan)抑制。用RT -PCR的方法检测到在AngRem10 4基因过度表达时FN的表达明显上调 ,而当反义阻断AngRem10 4基因的表达时 ,在AngⅡ刺激下人系膜细胞FN的表达无明显改变。结论 :AngRem10 4是在正常人组织内?

新基因AngRem104对纤粘连蛋白基因上游序列的调控分析

目的:探讨新基因AngRem104对纤粘连蛋白(FN)基因启动子转录活性的影响,为揭示AngRem104对FN表达的调控机制提供线索。方法:构建了FN基因上游调控序列的系列缺失体-荧光素酶(luciferase)报告基因,瞬时转染人系膜细胞,检测报告基因的活性变化。结果:FN507-pGL3+正义AngRem104质粒转染组和FN1280-pGL3+正义AngRem104质粒转染组的luciferase相对活性较FN122-pGL3+正义AngRem104质粒转染组luciferase相对活性明显升高(P<0.01)。结论:在FN基因上游调控序列中-122到-507之间存在新基因AngRem104的正反应调控区。

采用基因表达谱芯片技术筛选新基因AngRem104的功能相关基因

目的 采用基因芯片技术来筛选新基因AngRem104的功能相关基因,为进一步的基因功能研究提供线索。方法 建立新基因AngRem104的正义和反义表达的系膜细胞模型,应用含有4000个人类基因的cDNA表达谱芯片,对过量表达AngRem104基因和抑制表达AngRem104基因的人肾小球系膜细胞RNA表达进行检测。部分基因的差异表达由RT-PCR方法来验证。结果 筛选出的差异表达基因共96个,其中94个基因上调表达,2个基因下调表达。差异表达的基因涉及到细胞外基质和受体蛋白、细胞信号传导相关基因、DNA结合及转录相关蛋白、免疫相关蛋白、细胞骨架和动力蛋白和细胞合成及代谢相关蛋白等。特别是纤连蛋白(FN)及整合素β1(integrin β1)表达明显上调。RT-PCR的方法也证实了AngRem104与FN表达的相关性。结论 应用作为研究基因功能有效手段的基因表达谱芯片技术来筛选新基因AngRem104的功能相关基因,发现AngRem104与FN的表达有关,为其功能研究提供了重要线索。

新基因AngRem104与糖皮质激素受体特异延伸因子的相互作用

目的应用免疫共沉淀技术,验证新基因AngRem104和糖皮质激素受体特异延伸因子(GR-EF)蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用,为进一步研究AngRem104的生理功能奠定基础。方法构建AngRem104-pcDNA3.1/V5-His和GR-EF-pCMV/c-myc融合表达载体,共转染HEK293T细胞。分别用小鼠抗人c-myc单克隆抗体和小鼠抗人V5-HRP抗体进行免疫沉淀和免疫印迹,以验证AngRem104和GR-EF蛋白间的相互作用。结果AngRem104-V5融合蛋白能够在c-myc抗体的免疫沉淀物中检测出来;在V5抗体的免疫沉淀物中也能检测到GR-EF-c-myc融合蛋白。结论新基因AngRem104和GR-EF蛋白在哺乳动物细胞中存在直接相互作用。

血管紧张素Ⅱ上调人肾小球系膜细胞硬化相关基因的克隆

目的 筛选和鉴定培养的人肾小球系膜细胞（MsC）在血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）作用下,产生以纤连蛋白（Fibronectin,FN）为代表的细胞外基质成分的过程中上调表达的基因,寻找Ang Ⅱ致细胞外基质堆积作用的相关基因,为探讨Ang Ⅱ在肾小球硬化发展过程的分子机制奠定基础。方法 人MsC经Ang Ⅱ（10-6mol/L）刺激24h后,采用抑制性消减杂交（suppressionsubtractive hybridization,SSH）获得Ang Ⅱ相关的差异表达的cDNA,经纯化克隆到pGEM-Teasy Vector并转化大肠杆菌;随机选择120个克隆,经反向Northern筛选上调表达的基因cDNA片段,并以Northern杂交验证,然后进行DNA序列测定和同源性比较。采用5＇-和3＇-RACE及长距离PCR的方法获得新基因的全长cDNA。结果 在120个随机选择的克隆中,反向Northern结果表明有55个克隆表达明显上调。挑选其中20个克隆进行DNA序列测定,结果显示18个为独立的基因片段序列（有两个序列为双拷贝）,其中15个为已知基因,包括细胞外基质成分:如血小板反应素Ⅰ、Ⅰ型胶原α2;细胞骨架及结合蛋白:如平滑肌肌动蛋白α、钙调蛋白1、γ-胞浆型肌动蛋白等;合成和代谢相关蛋白:如醛缩酶A、延长因子1-γ、arnesyl pyrophosphate synthetase等;蛋白分解相关蛋白:如组织蛋白酶。